沈燁宇，劉文斌

(南京明基醫(yī)院眼科，江蘇南京 210019)

·論著·

STZ 性糖尿病性大鼠白內障的AQP0、AQP1下調表達及Ca2+內流參與機制

沈燁宇，劉文斌

(南京明基醫(yī)院眼科，江蘇南京 210019)

目的分析鈣內流及水通道蛋白AQP0/1在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠白內障發(fā)病中的參與機制，為相關研究與臨床治療提供參考。方法40只糖尿病大鼠隨機分為糖尿病模型組(n=20)和藥物干預組(鈣通道阻滯劑硝苯地平組，n=20)，20只同批次相同飼養(yǎng)條件的大鼠作為正常對照組。藥物干預組大鼠第5周到8周持續(xù)給予鈣通道阻滯劑硝苯地平灌胃治療(60 mg/kg)，共持續(xù)4周。Western blot分析各組中AQP0/1及炎癥因子IL-6的表達。結果與對照組比較，糖尿病模型組大鼠晶狀體中AQP0/1表達下調(P＜0.01)，IL-6表達上調(P＜0.01)；與糖尿病模型組比較，鈣通道阻滯劑可以部分恢復AQP0/1的異常作用(P＜0.05)，對IL-6也有一定的改善作用(P＜0.05)。結論高血糖誘發(fā)炎癥因子IL-6上調表達，并進一步增強細胞鈣內流及AQP0/1下調表達。

糖尿?。话變日?；AQP；鈣內流；IL-6

隨著人口老齡化、生活方式的改變以及診療技術的提高，糖尿病患病人數(shù)迅速增加[1-2]。糖尿病已成為嚴重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。世界范圍內糖尿病發(fā)病率高達2%，成為除腫瘤、冠心病、腦血管病以外的第四大威脅人類健康的疾病。糖尿病性白內障是其重要的并發(fā)癥之一，是臨床上嚴重的致盲性眼病之一。水通道蛋白在機體各個組織中均有廣泛的表達，其對水分的有效運轉對維持眼睛的正常功能具有重要的作用[3-5]。

本文通過腹腔注射復制糖尿病大鼠白內障模型，探討水通道蛋白、鈣內流及炎癥因子IL-6在其發(fā)生發(fā)展中的作用，為相關的研究和臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品及試劑 SD大鼠，雌雄不拘，由浙江省實驗動物中心提供；鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購自美國Sigma公司；兔抗鼠AQP0/1抗體、兔抗IL-6抗體(美國Santa Cruz公司)、HRP標記的二抗及DAB顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器 低溫高速離心機由德國Eppendorf生產；PCR儀及凝膠成像儀購自Bio-RAD公司；CO2培養(yǎng)箱購自上海新苗儀器廠；蛋白質電泳儀(DYY-7C)購自北京市六一儀器廠。

1.3 動物模型復制 采用STZ(60 mg/kg)腹腔注射復制大鼠糖尿病模型，選擇持續(xù)8周血糖水平超過16.7 mmol/L者作為糖尿病大鼠。40只糖尿病大鼠隨機分為糖尿病模型組(n=20)和藥物干預組(鈣通道阻滯劑硝苯地平組，n=20)，20只同批次相同飼養(yǎng)條件的大鼠作為正常對照組。藥物干預組大鼠第5周到8周持續(xù)給予鈣通道阻滯劑硝苯地平灌胃治療(60 mg/kg)，共持續(xù)4周。每只大鼠自由飲水，每天給予15 g標準大鼠飼料。STZ注射8周后處理動物，血樣被收集離心(4 000 g，15 min，4°C)，分離血清進行生化分析。

1.4 Western blot 三組大鼠在處死之后立即于冰面上取0.1 g晶狀體組織，加入0.5 ml裂解液，冰浴中充分勻漿。勻漿液13 000 g，4°C離心20 min，吸取上清以考馬斯亮藍測定蛋白含量后，計算含50 μg蛋白的加樣體積。將蛋白樣品與1/4體積的5×SDS加樣緩沖液混合，沸水煮沸5 min變性。經SDS-PAGE電泳后，將蛋白電轉至硝酸纖維素膜上，封閉液室溫封閉1 h，然后按照順序依次加入一抗和二抗進行孵育。PBST洗3次，每次15 min,DAB顯色，UVP影像分析系統(tǒng)照相，以β-actin作為蛋白表達內參照。

1.5 觀察指標 觀察正常對照組、糖尿病模型組及藥物干預組大鼠的一般狀態(tài)(包括飲水、尿量、體重、毛色以及晶狀體狀態(tài))、血清血糖及膽固醇水平的變化以及晶狀體中AQP0/1蛋白和IL6蛋白的表達變化。

1.6 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件完成。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差()表示，多組間比較采用單因素ANOVA分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物一般狀態(tài)觀察注射STZ后，成模動物飲水、尿量明顯增加，體重減輕，皮毛光澤差。同時，采用裂隙燈觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠晶狀體周邊可見到空泡，且有絮狀混濁。解剖前模型組大鼠晶狀體完全混濁，鈣通道阻滯劑西苯地平干預組大鼠晶狀體混濁程度較模型組輕。而對照組大鼠的晶狀體全部透明。

2.2 糖尿病大鼠血糖及總膽固醇水平變化 糖尿病模型組和藥物干預組大鼠血糖水平分別為(28.5±2.54)mmol/L和(26.3±3.10)mmol/L。與對照組比較，糖尿病組和藥物干預組大鼠血糖水平明顯升高，且差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，但兩組之間相比差異則無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；同時，與對照組相比，糖尿病組大鼠總膽固醇水平也明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)，但與藥物干預組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 糖尿病大鼠血糖及總膽固醇水平變化()

表1 糖尿病大鼠血糖及總膽固醇水平變化()

2.3 藥物干預組上調被抑制的AQP0/1表達 糖尿病模型組大鼠AQP0/1的蛋白質表達較對照組均明顯下調，且其差異具有統(tǒng)計學意義，鈣通道阻滯劑硝苯地平可部分恢復異常表達的AQP0/1，見圖1。

2.4 藥物干預上調被抑制的炎癥因子IL-6的表達 糖尿病模型組組大鼠IL-6的蛋白質表達較對照組均明顯上調(P＜0.01)，且差異具有統(tǒng)計學意義，鈣通道阻滯劑硝苯地平對異常表達的IL-6有明顯的改善作用(P＜0.05)，見圖2。

圖1 鈣通道阻滯劑NIF上調被抑制的AQP0/1表達

圖2 鈣通道阻滯劑NIF上調被抑制的炎癥因子IL-6表達

3 討論

糖尿病與腫瘤、高血壓等是嚴重影響人類健康的疾病。糖尿病的發(fā)病率和死亡率有逐年升高的趨勢，其微血管病變和大血管病變導致的并發(fā)癥是目前其致死、致殘的重要原因。研究證實，糖尿病及其并發(fā)癥的主要發(fā)病分子機制包括[6-9]：長期持續(xù)的高血糖可引起諸如蛋白質，脂類等生物大分子糖基化，產生大量晚期糖基化終末產物(Advanced glycation end products，AGEs)，造成AGEs在體內聚集，最終使蛋白發(fā)生交聯(lián)，導致血管剛性增強和通透性增高；體內細胞因子異常表達，導致機體炎癥反應并誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥；AGEs還可以介導還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶(NOX)的激活，導致細胞內NAD(P)H的水平下降，從而抑制內皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活性，減少舒血管物質NO的生成。其中糖尿病視網膜病變是其主要的微血管并發(fā)癥之一，但是目前對其確切的發(fā)病機制尚不明確。本文采用一次性大劑量腹腔注射STZ復制糖尿病大鼠視網膜病變模型，分析了鈣內流及水通道蛋白AQP0/1在STZ誘導的糖尿病大鼠白內障發(fā)病中的參與機制，為相關研究與臨床治療提供參考。

IL-6是機體免疫反應的重要因子，其可以延長中性粒細胞的凋亡過程，促進中性粒細胞氧化反應。魏巍等[10]探討2型糖尿病合并缺血性腦卒中患者血清核因子(NF-κB)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的變化，結果發(fā)現(xiàn)血清NF-κB、IL-6、TNF-α表達水平與疾病發(fā)生、發(fā)展和轉歸密切相關；血管損傷、炎癥因子釋放可能在患者的發(fā)病過程中具有重要作用。趙軍等[11]檢測2型糖尿病患者眼房水中血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)和瘦素(Leptin)的含量，結果發(fā)現(xiàn)VEGF、IL-6、瘦素在糖尿病性視網膜病變的形成過程中有重要作用，且VEGF與IL-6、VEGF與瘦素之間有相關性。本文中也發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠晶狀體IL-6蛋白質表達較對照組大鼠均明顯下調(P＜0.01)，且差異具有統(tǒng)計學意義，而鈣通道阻滯劑硝苯地平對恢復異常表達的IL-6有明顯作用(P＞0.05)，提示IL-6參與了糖尿病大鼠白內障的發(fā)病過程，且鈣離子內流可能是由IL-6所調節(jié)。

水通道蛋白(AQP)是體內一類介導水沿著滲透壓梯度被動運輸?shù)牡鞍踪|，其參與晶狀體的水分代謝對晶狀體生理動態(tài)平衡和晶狀體的透明性具有決定性的作用[12-13]。本文發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型組大鼠晶狀體AQP0/1的表達較對照組均明顯下調，且與正常對照組相比具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。同時我們在觀察大鼠晶狀體時也發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠晶狀體透明而模型組晶狀體嚴重出現(xiàn)渾濁，這與AQP的表達具有一致性。因此，大鼠晶狀體的AQP0/1蛋白對大鼠晶狀體功能的正常維系具有重要的作用，即水分的正常代謝在晶狀體發(fā)揮正常生理功能的組成部分。同時，鈣離子通道阻滯劑硝苯地平藥物干預可以部分恢復糖尿病模型組大鼠晶狀體AQP的異常表達，提示鈣離子內流可能部分影響AQP蛋白的表達。

因此，糖尿病白內障與晶狀體內水通道蛋白和IL-6的異常表達有關，其機制可能是高血糖誘發(fā)炎癥因子IL-6上調表達，并進一步增強細胞鈣內流及AQP0/1下調表達。

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Depressed expression of AQP0/1 and Ca2+influx involved in STZ-induced diabetic cataract.

SHEN Ye-yu,LIU Wen-bin.
Department of Ophthalmology,Nanjing Benq Hospital,Nanjing 210019,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo explore the involvement of AQP0/1 and Ca2+influx in streptozotoxin(STZ)-induced diabetic cataract.MethodsForty male SD rats were divided into diabetic model group(n=20)and calcium channel blocker(nifedipine)group(n=20),while 20 normal rats were taken as control group.The diabetic model group was replicated by injection of streptozotoxin(STZ),and calcium channel blocker group was given 60 mg/kg nifedipine from the fifth week to the eighth week.The concentration of serum blood glucose and cholesterol was analyzed.The expression of AQP0/1 and IL-6 were detected by Western blot.ResultsCompared with the control group,the expression of AQP0/1 were down-regulated and the expression of IL-6 was up-regulated in diabetic model group(P＜0.01).Compared with diabetic model group,the abnormal expression of AQP0/1 and IL-6 was significantly alleviated in calcium channel blocker group(P＜0.05).ConclusionHigh concentration of glycemia upregulated the expression of IL-6 which enhanced the downregulated expression ofAQP0/1.

Diabetes;Cataract;AQP;Calcium influx;IL-6

R-332

A

1003—6350（2014）22—3290—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.22.1291

2014-04-10)

劉文斌。E-mail：sunnyrain_98@126.com