潘富文，吳林清

(海南省農(nóng)墾三亞醫(yī)院骨科，海南三亞 572000)

·論著·

去細(xì)胞神經(jīng)支架聯(lián)合VEGF 修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究

潘富文，吳林清

(海南省農(nóng)墾三亞醫(yī)院骨科，海南三亞 572000)

目的觀察去細(xì)胞神經(jīng)支架聯(lián)合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用。方法購買雄性Wistar大鼠60只，先取15只成年Wistar大鼠作為神經(jīng)供體，制備去細(xì)胞神經(jīng)支架，將制備好的神經(jīng)支架剪取長度約為1 cm的去細(xì)胞神經(jīng)基膜管。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，將余Wistar大鼠隨機(jī)分為三組，每組大鼠均15只。實(shí)驗(yàn)組(A組)為去細(xì)胞神經(jīng)支架移植+局部注射VEGF組；對照組Ⅰ(B組)為去細(xì)胞神經(jīng)支架移植組；對照組Ⅱ(C組)為自體神經(jīng)移植組。術(shù)后喂養(yǎng)1個(gè)月，并每日觀察大鼠步態(tài)、患足潰瘍恢復(fù)情況。術(shù)后1個(gè)月取移植段坐骨神經(jīng)組織行HE染色、免疫組化染色觀察再生神經(jīng)S-100及軸突數(shù)量，髓鞘、神經(jīng)纖維數(shù)等生長情況。結(jié)果術(shù)后1個(gè)月，三組大鼠的足部潰瘍、步態(tài)均有不同程度的恢復(fù)，其中實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)率接近于自體神經(jīng)移植組，明顯優(yōu)于單純?nèi)ゼ?xì)胞神經(jīng)支架移植組；A組的再生神經(jīng)軸突數(shù)為(125.34±5.67)，B組再生神經(jīng)軸突數(shù)為(62.32±3.71)，C組再生神經(jīng)軸突數(shù)為(132.55±7.48)，A組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，A組與B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論去細(xì)胞神經(jīng)支架聯(lián)合VEGF在促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)過程中可能具有一定的作用。

神經(jīng)修復(fù)；神經(jīng)支架；周圍神經(jīng)；化學(xué)去細(xì)胞

周圍神經(jīng)損傷是手足顯微外科的常見病、多發(fā)病，其損傷后修復(fù)一直以來是治療的難點(diǎn)。即使患者經(jīng)過較為科學(xué)的治療，患肢功能得到了較大程度的恢復(fù)，但仍然留下不同程度的后遺癥，給患者日后的正常生活帶來巨大的不便。因此，提高周圍神經(jīng)損傷的診斷及治療，恢復(fù)其功能，提高生活質(zhì)量已成為臨床醫(yī)師研究和關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)組織工程學(xué)研究的深入發(fā)展，許多學(xué)者已經(jīng)意識(shí)到一些材料、生長因子及細(xì)胞在神經(jīng)修復(fù)過程中發(fā)揮著一定的作用。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)作為血管生成微肽類蛋白，可以促進(jìn)血管的再生，增加血管壁的通透性，能通過改善微循環(huán)間接地起到神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)也可以作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子對神經(jīng)系統(tǒng)起到維持與保護(hù)的作用[2-3]，而去細(xì)胞神經(jīng)支架具有良好的完整性，組織相容性及生物力學(xué)穩(wěn)定性。筆者為此將二者聯(lián)合應(yīng)用于大鼠周圍神經(jīng)損傷的治療中，以探討該組織工程神經(jīng)在神經(jīng)修復(fù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠60只(海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供)，體重(250±25)g，選取45只隨機(jī)分為A、B、C三組，每組15只；另外15只作為坐骨神經(jīng)供體。

1.1.2 主要試劑與材料 VEGF(30 μg/ml)溶液購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，曲拉通100 (Triton-100)購自北京翰譜醫(yī)藥生物研究所，脫氧膽酸鈉購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組織化學(xué)染色超敏試劑盒(S-P超敏試劑盒鼠/兔)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 方法 A組為實(shí)驗(yàn)組，采用去細(xì)胞神經(jīng)支架移植+局部注射VEGF治療，B組僅采用去細(xì)胞神經(jīng)支架移植組，C組僅采用自體神經(jīng)移植。先用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射，麻醉成功，取大腿后側(cè)入路，直視下依次切開皮膚，皮下，分離肌肉，顯露坐骨神經(jīng)，在放大10倍的手術(shù)顯微鏡下，分別對三組大鼠組進(jìn)行造模。用10-0顯微縫線，等間距縫合神經(jīng)外膜，術(shù)后在實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)大鼠1個(gè)月，術(shù)后A組每日按時(shí)在臀大肌注射濃度為VEGF(30μg/ml)[4]的液體5 ml，并觀察、記錄大鼠的步態(tài)、傷口愈合、足底潰瘍愈合等情況，并行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.3 HE染色 切取厚度為4～5 μm的石蠟切片，并烤干(時(shí)間約為2 h)。①脫蠟：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各放置10 min；②脫水：無水乙醇梯度脫水后置于蒸餾水洗3～5 min。③染色：染色、返藍(lán)各2 min。④水洗：再次用梯度乙醇水洗脫水。⑤封片：光鏡下觀察。

1.4 免疫組化染色①切片脫蠟至用磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.01 mol/L，pH 7.4)沖洗3次，每次3 min。②進(jìn)行組織抗原相關(guān)修復(fù)。③每張切片滴加1滴過氧化酶阻斷溶液(試劑A)，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min。④除去PBS液，每張切片滴加1滴正常非免疫動(dòng)物血清(試劑B)，室溫下孵育10 min。⑤除去血清，每張切片滴加1滴的第一抗體(S-100)，2 h后用PBS沖洗3次，每次3～5 min。⑥除去PBS液，每張切片滴加1滴生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次，每次3 min。⑦除去PBS液，每張切片滴加1滴鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次，每次3 min。⑧除去PBS液，每張切片滴加2滴新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10 min，顯色合適后即刻進(jìn)行先一步。⑨自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗返藍(lán)，梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察結(jié)果 術(shù)后4周，A組與C組大鼠足部紅腫及潰瘍基本完全愈合，步態(tài)基本恢復(fù)正常，雙后足能站立。B組恢復(fù)相對較差，仍有7只患足潰瘍未愈。取材行組織學(xué)觀察時(shí)見各組移植神經(jīng)組織輕度粘連，A組、C組神經(jīng)移植物表面毛細(xì)血管網(wǎng)清晰可見，移植物近端稍稍膨大，遠(yuǎn)端塌陷較輕，神經(jīng)移植物的連續(xù)性及結(jié)構(gòu)的完整性較為良好，而B組移植物塌陷相對較為嚴(yán)重，見圖1～圖4。

2.2組織學(xué)HE染色結(jié)果術(shù)后4周，A、C組再生雪旺細(xì)胞數(shù)量較多，神經(jīng)纖維束呈圓形或橢圓形，整齊排列。纖維束周邊有大量的新生毛細(xì)血管，A組與C組有髓神經(jīng)纖維數(shù)量多，髓鞘及軸突清晰可見，排列整齊，密度均勻，髓鞘厚度均一，明顯優(yōu)于B組，見圖5～圖7。

2.3 組織學(xué)免疫組化染色結(jié)果術(shù)后4周，S-100蛋白縱、橫切片染色均呈棕黃色，A組、C組切片著色均勻、基本一致，雪旺細(xì)胞數(shù)量較多，排列整齊，僅僅環(huán)繞于神經(jīng)鞘管周圍，細(xì)胞大小基本一致。而B組切片著色較淡，雪旺細(xì)胞數(shù)量相對較少，細(xì)胞大小形態(tài)不一，雪旺細(xì)胞排列較疏松，見圖8～圖10。

2.4 圖像分析結(jié)果術(shù)后4周，A、B、C組再生神經(jīng)纖維數(shù)量、軸突數(shù)比較，A組和C組均優(yōu)于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而A組和C組兩組間比較差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 術(shù)后4周各組再生神經(jīng)纖維數(shù)、軸突數(shù)比較（n=15，，只/HP)

表1 術(shù)后4周各組再生神經(jīng)纖維數(shù)、軸突數(shù)比較（n=15，，只/HP)

注：與A組比較，aP＜0.05，bP＞0.05；cP＜0.05，dP＞0.05。

3 討論

一直以來自體神經(jīng)移植都被認(rèn)為是神經(jīng)修復(fù)的最佳方法，該方法猶如拆西墻補(bǔ)東墻，也存在問題，如供區(qū)皮膚感覺障礙、神經(jīng)痛、瘢痕形成等。周圍神經(jīng)組織工程研究包括神經(jīng)支架、生長因子、細(xì)胞及兩者或者三者相互作用。去細(xì)胞神經(jīng)具備神經(jīng)再生的天然三維結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)，免疫原性低，具有良好的應(yīng)用前景[5]。雪旺細(xì)胞作為周圍神經(jīng)組織工程的種子細(xì)胞能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)，其在周圍神經(jīng)再生中的重要作用已被廣泛證實(shí)[6]。VEGF可促進(jìn)移植物的毛細(xì)血管生成，為雪旺細(xì)胞的存活，神經(jīng)元、軸突長時(shí)間存活提供了較為理想的基礎(chǔ)環(huán)境，作為一種神經(jīng)保護(hù)因子，可直接或者間接地促進(jìn)神經(jīng)元、軸突及髓鞘等生長，促進(jìn)軸突再生，啟動(dòng)并激活雪旺細(xì)胞延伸、增殖與分化，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)的再生修復(fù)[2，7]。之前許多學(xué)者研究已經(jīng)證實(shí)，組織工程神經(jīng)具有存進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的作用。本實(shí)驗(yàn)借鑒他人的研究經(jīng)驗(yàn)，將去細(xì)胞神經(jīng)支架移植于大鼠坐骨神經(jīng)缺損處，實(shí)驗(yàn)組外加注射VEGF。結(jié)果顯示，神經(jīng)支架移植+局部注射VEGF組，在步態(tài)恢復(fù)、足部潰瘍的恢復(fù)上明顯優(yōu)于單純神經(jīng)支架移植組，接近于自體神經(jīng)移植組。說明去細(xì)胞神經(jīng)支架聯(lián)合VEGF具有促進(jìn)周為神經(jīng)修復(fù)再生的作用。

本實(shí)驗(yàn)引入的是同種異體去細(xì)胞神經(jīng)支架，該神經(jīng)支架具有免疫原性低、組織相容性、穩(wěn)定性、三維仿生性等。為神經(jīng)修復(fù)再生營造一個(gè)相對穩(wěn)定的再生微環(huán)境及營養(yǎng)物質(zhì)交換的場所，為雪旺細(xì)胞再生、軸突再生、神經(jīng)纖維束植入奠定良好的基礎(chǔ)。近年來研究表明，VEGF可以促進(jìn)神經(jīng)微小血管的生成，同時(shí)也具有營養(yǎng)神經(jīng)的作用，可被視為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子?？梢源龠M(jìn)施旺細(xì)胞增生，神經(jīng)軸突突起的長度，促進(jìn)神經(jīng)損傷后的再生及功能恢復(fù)[8]。在神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)加入VEGF，可以提高神經(jīng)移植修復(fù)的療效，并且VEGF對某些代謝毒素引起的神經(jīng)損害具有一定的逆轉(zhuǎn)及保護(hù)作用[9-10]。Pereira Lopes等[11]在實(shí)驗(yàn)研究中實(shí)驗(yàn)組引入了VEGF治療SD大鼠坐骨神經(jīng)缺損，對照組單純注射等劑量的生理鹽水，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)修復(fù)效果明顯優(yōu)于對照組。本實(shí)驗(yàn)術(shù)后4周，行組織形態(tài)學(xué)觀察，神經(jīng)支架移植+局部注射VEGF組和自體神經(jīng)移植組再生雪旺細(xì)胞數(shù)量較多，神經(jīng)纖維束呈圓形或橢圓形，整齊排列。纖維束周邊有大量的新生毛細(xì)血管，神經(jīng)支架移植+局部注射VEGF組和自體神經(jīng)移植組有髓神經(jīng)纖維數(shù)量多，髓鞘及軸突清晰可見，排列整齊，密度均勻，髓鞘厚度均一，明顯優(yōu)于單純神經(jīng)支架移植組。S-100蛋白縱、橫切片染色均呈棕黃色，神經(jīng)支架移植+局部注射VEGF組和自體神經(jīng)移植組雪旺細(xì)胞數(shù)量較多，排列整齊，僅僅環(huán)繞于神經(jīng)鞘管周圍，細(xì)胞大小基本一致。而單純神經(jīng)支架移植組雪旺細(xì)胞數(shù)量相對較少，細(xì)胞大小形態(tài)不一，雪旺細(xì)胞排列較疏松。結(jié)果與許多學(xué)者的研究結(jié)果不謀而合。說明神經(jīng)支架移植+局部注射VEGF具有一定的促進(jìn)神經(jīng)雪旺細(xì)胞增殖、分化以及促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的作用。

周圍神經(jīng)損傷后在修復(fù)過程中，雪旺細(xì)胞的增殖與分化起著決定性的作用，雪旺細(xì)胞在增殖的過程中分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子，而它們會(huì)正反饋的促進(jìn)雪旺細(xì)胞圍繞著神經(jīng)微絲外圍生長，形成髓鞘，進(jìn)而為神經(jīng)微絲、微管及軸突的延伸營造了良好的環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)術(shù)后4周，組織形態(tài)學(xué)結(jié)果較好的詮釋了大體觀察大鼠步態(tài)、足部潰瘍的恢復(fù)情況。但依然存在一些諸如神經(jīng)支架遠(yuǎn)端的塌陷是否影響神經(jīng)軸突的再生等問題，這些問題仍有待于日后的研究逐步解決。

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Experimental research of acelluar nerve scaffold in combination with VEGF in the treatment of peripheral nerve defect.

PAN Fu-wen,WU Lin-qing.Department of Orthopedics,Sanya Land Reclamation Hospital,Sanya 572000,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of VEGF in combination with acellular nerve scaffold on repairing peripheral nerve defect.MethodsSixty male Wistar rats were bought,15 of which were selected as nerve donors.The acellular nerve scaffolds were prepared and then cut into 1 cm acellular nerve basal laminas.According to experimental design,the rest 45 rats were randomly divided into three groups,with 15 in each group.Group A(the experimental group)was treated with both VEGF and acellular nerve scaffolds transplantation,group B(control groupⅠ) with just acellular nerve scaffolds transplantation,group C(control groupⅡ)with nerve autograft.After surgery,the recovery of the rats'gait and plantar ulcer were observed every day.After one month of the surgery,the regenerative nerves'S-100 protein,number of axon,growth of myelin sheath and nerve fiber were observed by HE staining and immunohistochemical staining of the transplanted sciatic nerve tissue.ResultsOne month after the surgery,the three groups showed different recovery levels of the rats'gait and plantar ulcer.The recovery rate of group A was close to that of group C,but significantly higher than that of group B.The number of regenerative nerve axon of group A,B and C was(125.34±5.67),(62.32±3.71),and(132.55±7.48),respectively.They were no statistically significant difference between groupAand group C(P＞0.05),while the difference between groupAand group B was statistically significant(P＜0.05).ConclusionVEGF in combination with allogenic acellular nerve can help repairing peripheral nerve defect.

Nerve repair;Nerve scaffold;Peripheral nerve;Chemically acellular

R-332

A

1003—6350（2014）22—3283—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.22.1289

2014-09-06)

潘富文。E-mail：724269424@qq.com