李秀麗，谷芳，姚元慶，劉忠宇

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院海南分院婦產(chǎn)科，海南三亞 572014；2.中國人民解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100853）

·論著·

VEGF111b的表達載體構(gòu)建及抗體制備

李秀麗1，谷芳2，姚元慶2，劉忠宇2

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院海南分院婦產(chǎn)科，海南三亞 572014；2.中國人民解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100853）

目的克隆VEGF111b基因，構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1-VEGF111b，并進行測序，制備VEGF111b多克隆抗體。方法絲裂霉素C誘導(dǎo)處理卵巢癌SKOV3細胞24 h，設(shè)計VEGF111b酶切引物，以SKOV3細胞的cDNA為模板，通過PCR得到VEGF111b特異性基因產(chǎn)物，克隆入真核表達載體pcDNA3.1中，獲得重組真核表達載體pcDNA3.1-VEGF111b，測序驗證。用KLH耦聯(lián)VEGF111b特異性短肽，制備多克隆抗體，Western blot檢測其特異性。結(jié)果成功擴增了VEGF111b基因，雙酶切、測序鑒定證實目的基因成功克隆到真核表達載體pcDNA3.1中，測序結(jié)果與預(yù)測完全一致，成功制備了VEGF111b多克隆抗體，使用其多克隆抗體，Western blot能夠檢測到VEGF111b對應(yīng)分子量的蛋白條帶。結(jié)論本研究鑒定了pcDNA3.1-VEGF111b真核表達載體，并驗證了VEGF111b多克隆抗體的特異性，為進一步研究VEGF111b蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

VEGF111b；pcDNA3.1；真核表達；多克隆抗體

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率逐年升高。隨著對卵巢腫瘤病因?qū)W和化療抵抗發(fā)生機制研究的逐漸深入，人們將治愈卵巢癌的希望寄予分子靶向治療，其中抗血管生成治療因其療效顯著而格外引人注目[1-2]。人VEGF-A基因位于染色體6p21.3，目前證實的VEGF剪接變異體包括：①表達8a外顯子的VEGFxxx亞家族成員VEGF111、VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189和VEGF206，可以促進血管生成的活性；②表達8b外顯子的VEGFxxxb亞家族成員VEGF121b、VEGF145b、VEGF165b、VEGF1 83b和VEGF189b，可以抑制血管生成的活性；③不表達第8外顯子的VEGF148[3-5]。

2007年Mineur等6]報道了一種新的VEGFxxx亞家族成員VEGF111，VEGF111編碼序列由外顯子1、2、 3、4和8a剪接構(gòu)成。根據(jù)在正常生理狀態(tài)下，大部分組織細胞偏向表達VEGFxxxb，位于外顯子8中的遠端剪接位點(Distal splice site，DSS)與近端剪接位點(Proximal splice site，PSS)相比具有較強的剪接優(yōu)勢[7]，也就是說每一個VEGFxxx亞家族成員均應(yīng)該有相對應(yīng)的VEGFxxxb亞家族成員。

在我們的前期研究中，利用RT-PCR技術(shù)從絲裂霉素C作用的人卵巢癌SKOV3細胞中擴增出VEGF111b基因，首次證明了VEGF111b在卵巢癌細胞中誘導(dǎo)性表達[8]。本研究中將構(gòu)建VEGF111b真核表達載體進行雙酶切鑒定并核酸測序，制備VEGF111b多克隆抗體并檢測其特異性。這一結(jié)果為進一步全面和系統(tǒng)研究VEGF111b的功能奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人卵巢癌SKOV3細胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所，質(zhì)粒pcDNA3.1由本實驗室提供，Trizol試劑購自Invitrogen公司，TransScript First-Strand RT-PCR試劑盒購自北京全式金公司，DNA maker、XhoⅠ酶、BamHⅠ酶、T4DNA連接酶購自Fermentas公司，DNA純化試劑盒購自Qiagen公司。弗氏完全佐劑和不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒和蛋白Marker購自Thermo Scientific公司；0.2 μm NC膜購自Millipore公司；HRP標記的羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司；特異性抗原肽合成和DNA測序由北京諾賽基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)條件均為37℃、飽和濕度、5%CO2(V/V)條件下，用含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細胞。

1.2.2 實驗動物新西蘭長耳兔兩只，體質(zhì)量約2 kg，兩耳光滑，明顯可見耳靜、動脈，健康，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，購回后在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物飼養(yǎng)中心單只分籠飼養(yǎng)，室溫(20±2)℃，保證良好的光照和通風(fēng)條件。

1.2.3 VEGF111b表達載體構(gòu)建、雙酶切鑒定及DNA測序人卵巢癌SKOV3細胞在100 μg/ml的絲裂霉素C的作用下處理24 h，參照Invitrogen公司Trizol使用說明書提取SKOV3細胞的總RNA，利用紫外分光光度計定量并計算A260/A280比值。依照TransScript First-Strand RT-PCR試劑盒標準步驟，以SKOV3細胞總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，使用上游引物5'-AAA CTC GAG GCC GCC ACC ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG C-3'(下劃線為XhoⅠ酶切位點)和下游引物5'-AAA GGA TCC TCA GTC TTT CCT GGT GAG AGA TC TG-3'(下劃線為BamHⅠ酶切位點)進行PCR擴增。50 μl PCR反應(yīng)體系為：模板cDNA 2 μl，10 μmol/L上游引物1 μl，10 μmol/L下游引物1 μl，10×Buffer(Buffer含Mg2+) 5 μl，2.5 μM dNTPs 4 μl，Trans Taq HiFi DNA聚合酶0.5 μl，用無菌雙蒸水調(diào)反應(yīng)體系至50 μl。循環(huán)參數(shù)為：94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，檢測擴增產(chǎn)物。按照DNA純化試劑盒的操作說明回收DNA，以限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ進行雙酶切。50 μl酶切體系為：15 μl純化PCR產(chǎn)物，15 μl pcDNA3.1載體，1.5 μl XhoⅠ，1.5 μl BamHⅠ，10×Buffer溶液5 μl，用無菌雙蒸水調(diào)反應(yīng)體系至50 μl，37℃反應(yīng)16 h。用T4DNA連接酶將VEGF111b基因連接至質(zhì)粒pcDNA3.1的相應(yīng)酶切位點之間，獲得真核表達載體pcDNA3.1-VEGF111b，由北京諾賽公司進行DNA測序。

1.2.4 兔抗VEGF111b蛋白多克隆抗體的制備VEGF111b特異性抗原肽CRSLTRKD(Lot：5001602-2)由北京諾賽基因公司合成，然后用生理鹽水稀釋，與相應(yīng)的佐劑進行1:1混合形成穩(wěn)定乳劑。雄性新西蘭長耳兔兩只，在免疫前3 d取耳緣靜脈血作為陰性對照。初次免疫將100 μg VEGF111b特異性抗原肽溶液與等體積的完全弗氏佐劑混合(2 mg/ml)，進行背部皮下多點注射，每只0.5 ml；每隔兩周進行加強免疫，將50 μg抗原肽溶液與等體積的不完全佐劑按上述方法混合(1 mg/ml)，背部皮下多點注射，每只0.5 ml，加強免疫兩次；最后一次免疫一周后，取耳緣靜脈血進行ELISA效價分析。用VEGF111b的特異性抗原肽0.4 μg/孔包被酶標板，VEGF111b抗兔血清作一抗，免疫前兔血清作為陰性對照，進行倍比稀釋(1:1 000、1:2 000、1:4 000、1:8 000、1:16 000、1:32 000、1:64 000、1:128 000、1:256 000和1:512 000)，以HRP標記的羊抗兔單抗IgG為二抗(1:1 000稀釋)，加入鄰苯二胺(OPD)底物反應(yīng)液，37℃避光顯色5 min，加入反應(yīng)終止液，測定各孔的吸光度OD570nm值。效價達到要求后取頸動脈血，收集血清，過濾后硫酸銨沉淀法純化抗體。

1.2.5 Western blot檢測多克隆抗體的特異性提取絲裂霉素C處理24 h和未處理的卵巢癌SKOV3細胞的蛋白，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至0.2 μmNC膜，以5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST沖洗3次，每次10 min，以制備的VEGF111b多克隆抗體作為一抗(1: 500稀釋)，4℃過夜孵育，HRP標記的羊抗兔單抗IgG為二抗(1:1 000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST沖洗3次，每次10 min，最后進行ECL發(fā)光檢測。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建pcDNA3.1-VEGF111b表達載體、雙酶切鑒定及測序結(jié)果以人卵巢癌SKOV3細胞總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，使用VEGF111b含酶切位點的特異性引物，通過擴增、純化、酶切、連接，將VEGF111b基因連接至pcDNA3.1載體。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VEGF111b用XhoⅠ和BamHⅠ進行雙酶切后，2%瓊脂糖電泳圖譜顯示切出一個410 bp左右的DNA條帶，與預(yù)計插入片段大小相符，如圖1所示。其克隆基因測序結(jié)果顯示該基因大小為413 bp，并且與預(yù)測完全相符。經(jīng)BLAST軟件分析，與人VEGF165b基因序列同源性為78%，與VEGF111基因序列同源性為95%，在人基因組數(shù)據(jù)庫中未找到與該序列完全一樣的同源基因，故本實驗誘導(dǎo)所得基因序列為新序列。

圖1 pcDNA3.1-VEGF111b表達載體雙酶切鑒定

2.2 VEGF111b多克隆抗體的制備用VEGF111b的特異性抗原肽CRSLTRKD作為抗原，免疫兩只新西蘭雄兔，ELISA法檢測抗血清效價，IgG抗體滴度均已達到1.28×105，抗體效價已達到實驗要求，如圖2所示。取抗體滴度比較高的2號兔，收集血清后用硫酸銨沉淀法純化抗血清，得到高純度的VEGF111b多克隆抗體。

圖2 VEGF111b抗血清稀釋度(×103)

2.3 VEGF111b多克隆抗體特異性檢測使用制備的VEGF111b多克隆抗體，經(jīng)Western blot檢測表明，能夠特異性識別絲裂霉素C處理后的卵巢癌SKOV3細胞中的VEGF111b的表達，蛋白條帶位置在10～15 kD之間，如圖3所示，符合我們預(yù)測的VEGF111b蛋白分子量。圖3中泳道1為絲裂霉素處理后SKOV3細胞，泳道2為未處理的SKOV3細胞，在未處理的卵巢癌中未檢測到VEGF111b蛋白的表達，與我們前期的研究結(jié)果一致[8]。

圖3 VEGF111b多克隆抗體檢測

3 討論

自從VEGF165b發(fā)現(xiàn)[9]以來，研究者對其功能進行了廣泛研究，并陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了VEGFxxxb家族中其他成員，VEGF165b和VEGF121b均有強大的抗血管生成活性，極有可能作為抗血管制劑用于臨床腫瘤治療[5，10]。與現(xiàn)有的抗新血管生成制劑相比，VEGFxxxb具有明顯的優(yōu)越性。首先，VEGFxxxb存在于正常人體，不會因為誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生而引發(fā)異常免疫反應(yīng)[11]；其次，VEGFxxxb不會因抑制VEGFxxx而引發(fā)腸道穿孔、高血壓和蛋白尿等毒副作用[12]。在以前的研究中，我們使用RT-PCR技術(shù)在絲裂霉素C的作用下從卵巢癌SKOV3細胞成功克隆出VEGF111b基因序列，證實了VEGF111b在SKOV3細胞中誘導(dǎo)性表達[8]。與VEGF121b和VEGF165b相比，VEGF111b氨基酸序列中沒有纖溶酶和MMP切割位點，不僅不會喪失了抑制血管生成活性所必須的SLTRKD序列，而且不會產(chǎn)生具有促血管活性的VEGF110片段和VEGF113片段，因此VEGF111b生物活性更穩(wěn)定。此外，VEGF111b分子量較小，不含有肝素結(jié)合列，具有更好的擴散性能，易于到達腫瘤組織發(fā)揮其血管生成抑制作用[7]。因此，VEGF111b在VEGFxxxb家族中更具有優(yōu)勢。

目前尚未見任何有關(guān)VEGF111b的研究報道，更無可用的商品化檢測試劑，從蛋白水平進一步研究VEGF111b的理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)及作用機制非常困難[13]。因此在本研究中，我們構(gòu)建了pcDNA3.1-VEGF111b重組真核表達載體并進行了雙酶切鑒定，測序結(jié)果分析為人基因組數(shù)據(jù)庫中未找到的新序列，同時制備了VEGF111b多克隆抗體。成功構(gòu)建的高質(zhì)量的pcDNA3.1-VEGF111b重組載體及制備的多克隆抗體為后續(xù)轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞或純化VEGF111b蛋白研究其對血管形成及腫瘤生長的作用奠定了實驗基礎(chǔ)。

綜上所述，考慮到VEGF111b蛋白功能及抗原表位研究的重要性，本研究構(gòu)建的pcDNA3.1-VEGF111b真核表達載體及制備的VEGF111b多克隆抗體，這些為利用基因工程和蛋白重組技術(shù)來制備和純化有活性的VEGF111b重組蛋白創(chuàng)造了條件，為進一步研究VEGF111b的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of VEGF111b expression vector and preparation of VEGF111b antibody.

LI Xiu-li1,GU Fang2,YAO Yuan-qing2,LIU Zhong-yu2.
1.Department of Obstetrics and Gynecology,Hainan Branch of PLA General Hospital,Sanya 572014,Hainan,CHINA;2.Department of Obstetrics and Gynecology,PLA General Hospital,Beijing 100853,CHINA

ObjectiveTo clone the VEGF111b gene,construct eukaryotic expression system pcDNA3.1-VEGF111b,sequence VEGF111b gene,and prepare VEGF111b polyclonal antibody.MethodsWith VEGF111b-specific primers and RT-PCR,VEGF111b gene was amplified from ovarian cancer SKOV3 cells treated with mitomycin C for 24 h.PCR product was cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1to construct pcDNA3.1-VEGF111b,and was then sequenced.VEGF111b-specific peptide was connected KLH to prepare the polyclonal antibody.Western blot was used to detect its specificity.ResultsVEGF111b gene was successfully amplified by RT-PCR and it was proved to be cloned into pcDNA3.1vector by double digestion with restriction endonuclease and sequencing analysis.We have prepared VEGF111b polyclonal antibody successfully,and detected protein band of the corresponding molecular weight using the polyclonal antibody by Western blotting.ConclusionThis study not only identified eukaryotic expression vector pcDNA3.1-VEGF111b,but also verified the specificity of VEGF111b polyclonal antibody,which provides a basis for further research on VEGF111b function.

VEGF111b;pcDNA3.1;Karyotic expression;Polyclonal antibody

R737.31

A

1003—6350（2014）22—3277—04

2014-06-02)

國家自然科學(xué)基金(編號：81250030)

李秀麗。E-mail：lixiuli17@163.com