龐聰，田厚文

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所病毒病應(yīng)急技術(shù)中心，北京 102206

痘苗病毒曾在人類消除天花的戰(zhàn)役中起到關(guān)鍵作用，此后，它作為一種基因轉(zhuǎn)移載體，被廣泛用于針對(duì)多種感染性疾病，如艾滋病、流感、天花、瘧疾、結(jié)核等，以及許多腫瘤，如黑色素瘤、非小細(xì)胞型肺癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、直腸結(jié)腸癌、人乳頭瘤病毒（HPV）相關(guān)宮頸癌、乳腺癌等的基因工程重組疫苗的研究[1]。為了提高痘苗病毒載體的安全性，科學(xué)家們又發(fā)展出了非復(fù)制型痘苗病毒或復(fù)制缺陷型痘苗病毒，它們是對(duì)痘苗病毒進(jìn)行自然或基因工程減毒得到的在非允許細(xì)胞中無(wú)法有效復(fù)制的病毒株。非復(fù)制型痘苗病毒具備痘苗病毒的主要優(yōu)點(diǎn)：①多種細(xì)胞嗜性；②可插入大的基因片段（至少25 kb）[2]；③痘苗病毒載體疫苗不需要進(jìn)行蛋白純化，可在短時(shí)間內(nèi)大量生產(chǎn)，因此可以作為預(yù)防生物恐怖的儲(chǔ)備疫苗。另外，近年來(lái)腫瘤治療已從傳統(tǒng)的手術(shù)療法、放射療法、化學(xué)療法跨入免疫療法時(shí)代，這促進(jìn)了人們?nèi)パ芯咳绾卫貌《据d體激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，以利用機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗腫瘤。于是，非復(fù)制型病毒載體作為腫瘤的治療性疫苗紛紛進(jìn)入臨床前和臨床研究[1]。總之，以非復(fù)制型痘苗病毒為載體的重組疫苗在反恐和腫瘤治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

在該領(lǐng)域，目前國(guó)際上主要應(yīng)用的是改良痘苗病毒安卡拉株（modified vaccinia Ankara，MVA）和NYVAC；而國(guó)內(nèi)具有代表性的是本實(shí)驗(yàn)室具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的復(fù)制缺陷型痘苗病毒天壇株（NTV）。MVA是將土耳其的一株天花疫苗株痘苗病毒安卡拉株在雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）中自然傳代500次，丟失了15%的基因，包括免疫逃避和宿主范圍相關(guān)基因形成的病毒株[3]；NYVAC為痘苗病毒哥本哈根株（vaccinia virus Copenhagen，VACV-Cop）的衍生株，它在后者基礎(chǔ)上用基因工程技術(shù)人工刪除了18個(gè)開(kāi)放讀框，包括宿主范圍、毒力和致病性相關(guān)基因[4]；NTV是從我國(guó)用于天花預(yù)防接種的疫苗株痘苗病毒天壇株基因組中用基因工程技術(shù)人工選擇去除了與宿主范圍和毒力相關(guān)的26個(gè)基因，總長(zhǎng)21 243個(gè)核苷酸，獲得的復(fù)制缺陷型天壇株痘苗病毒[5]。

國(guó)際上，基于MVA和NYVAC的載體疫苗已大量進(jìn)入臨床研究[1]。為了發(fā)展基于我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的NTV載體疫苗，為未來(lái)針對(duì)各種感染性疾病和腫瘤的NTV重組疫苗的臨床研究奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，有必要了解和比較NTV、MVA和NYVAC等非復(fù)制型痘苗病毒的生物學(xué)性狀，明確痘苗病毒相關(guān)基因功能與生物學(xué)性狀的關(guān)系。故我們擬從以下幾方面對(duì)MVA、NYVAC和NTV生物學(xué)性狀的現(xiàn)有研究資料進(jìn)行總結(jié)和比較，為深入研究我國(guó)非復(fù)制型痘苗病毒天壇株的生物學(xué)性狀提供參考。

1 基因組結(jié)構(gòu)

作為痘病毒科脊椎動(dòng)物痘病毒亞科正痘病毒屬的一員，痘苗病毒的基因組為線狀雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。不同毒株之間的基因組大小略有差異，大體為180～200 kb。與痘病毒科其他成員相同，痘苗病毒基因組的中央通常為保守區(qū)，基因高度保守，編碼必要的與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白；而兩側(cè)通常為非保守區(qū)，基因變異較大，編碼與宿主范圍等相關(guān)的蛋白。

圖1 MVA、NYVAC和NTV的基因組結(jié)構(gòu)示意圖以VACV-Cop為參考，顯示MVA、NYVAC和NTV各自缺失的基因；MVA和NYVAC的示意圖來(lái)自文獻(xiàn)［1］，NTV示意圖參考文獻(xiàn)［5，11］繪制，其中C1L～C19L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L～K3L為構(gòu)建NTV時(shí)人工缺失（21.2 kb），其余基因是原痘苗病毒天壇株與VACV-Cop的天然差異

MVA、NYVAC和NTV各自的基因組結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。其中，一個(gè)宿主范圍基因C7L僅存在于MVA，而不存在于NYVAC和NTV；另一個(gè)宿主范圍基因K1L在三者中都被缺失或破壞。有研究表明，C7L的功能與病毒晚期蛋白正確合成的控制和凋亡相關(guān)[6]，而C7L和K1L都能抑制蛋白激酶（PKR）的活性[6-9]，并抑制Ⅰ型干擾素引發(fā)的抗病毒活性[10]?？梢酝茰y(cè)，一些重要基因的存在或缺失是導(dǎo)致3株病毒生物學(xué)性狀差異的重要原因。

2 體外生長(zhǎng)特性

病毒的體外生長(zhǎng)特性，如細(xì)胞嗜性，可以反映病毒細(xì)胞水平的宿主范圍。判斷病毒細(xì)胞嗜性的依據(jù)通常是，來(lái)自特異的組織或物種的細(xì)胞培養(yǎng)物是否能夠允許、半允許或不允許某種病毒在其中完成復(fù)制，病毒能在其中躲避宿主防御而成功復(fù)制的細(xì)胞即是該病毒的允許細(xì)胞。參與決定和影響病毒細(xì)胞嗜性的基因通常稱為病毒的宿主范圍基因（host range gene）[12]。

根據(jù)現(xiàn)有資料，我國(guó)的復(fù)制缺陷型痘苗病毒天壇株在允許細(xì)胞CEF上繁殖良好且能有效傳代；在非允許細(xì)胞2BS（人胚肺細(xì)胞）上不能繁殖和傳代，在143TK-（人骨髓瘤細(xì)胞）上只能產(chǎn)生極低滴度的子代病毒，且在這2種人源非允許細(xì)胞上均不能形成與原痘苗病毒天壇株一樣的典型病毒噬斑[5]。

一項(xiàng)關(guān)于MVA和NYVAC的比較性研究報(bào)道，在允許細(xì)胞BHK-21中，MVA和NYVAC的滴度與野生型痘苗病毒W(wǎng)R株（Western Reserve strain）基本持平，而在非允許細(xì)胞HeLa細(xì)胞中，前二者的滴度未升高而WR的滴度升高1萬(wàn)倍。該研究還發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在允許細(xì)胞BHK-21還是在非允許細(xì)胞HeLa（人源）、BSC-40（猴源）和3T3（鼠源）細(xì)胞中，NYVAC都比MVA形成的細(xì)胞病變更嚴(yán)重。有趣的是，在感染BHK-21后，NYVAC的細(xì)胞結(jié)合型病毒滴度低于MVA和WR，鑒于僅NYVAC感染的細(xì)胞在晚期有凋亡跡象，提示我們?cè)摻档涂赡苁荖YVAC引起的嚴(yán)重細(xì)胞破壞的結(jié)果[13]。

3種病毒的細(xì)胞嗜性總結(jié)如表1?？梢钥闯觯鼈?cè)贑EF和幼地鼠腎細(xì)胞BHK-21中能夠有效復(fù)制，在人源細(xì)胞中均不能有效復(fù)制。

3 病毒復(fù)制和形態(tài)發(fā)生

不同于其他DNA病毒，痘病毒在靶細(xì)胞的胞漿中復(fù)制。病毒基因表達(dá)受一種級(jí)聯(lián)機(jī)制嚴(yán)格調(diào)控，一般病毒感染后早期基因立即利用感染的毒粒中的酶和轉(zhuǎn)錄因子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，而中期和晚期基因在病毒DNA復(fù)制后才開(kāi)始轉(zhuǎn)錄[12,15-16]。病毒粒子的組裝是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程，涉及幾種病毒形態(tài)：在病毒進(jìn)入之后，早期基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致許多與宿主細(xì)胞相互作用的分子和病毒DNA合成的分子表達(dá)，該過(guò)程發(fā)生于被粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包圍的核旁工廠區(qū)，或者叫復(fù)制中心；中期和晚期基因，包括結(jié)構(gòu)蛋白、酶和早期轉(zhuǎn)錄因子隨后被轉(zhuǎn)錄。病毒DNA被包入未成熟病毒粒子（im?mature virion，IV），它隨后成熟為感染性的胞內(nèi)成熟病毒粒子（intracellular mature virion，MV），后者代表病毒生命周期中成熟的第一種感染性顆粒；一些MV被高爾基體的雙層膜包裹形成胞內(nèi)包膜病毒粒子（intracellular enveloped virion，WV）；在細(xì)胞表面，WV與宿主細(xì)胞膜融合，失去外層膜，形成細(xì)胞結(jié)合型包膜病毒粒子（cell-associated enveloped vi?rion，CEV）；CEV直接與細(xì)胞膜分離或通過(guò)誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白多聚化而從含有肌動(dòng)蛋白的微絨毛末梢脫離，最終形成胞外包膜病毒粒子（extracellular envel?oped virion，EV）[17]。雖然已了解 MVA、NYVAC 和NTV都失去了在人細(xì)胞和大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制和形成感染性病毒粒子的能力，但在三者中造成這種結(jié)果的具體機(jī)制各不相同。

含有C7L而K1L缺失的MVA的復(fù)制缺陷可能是由于病毒粒子包裝的阻斷。研究表明，MVA在HeLa細(xì)胞中的生活周期在感染后晚期被阻斷，此時(shí)由于病毒粒子包裝的阻斷僅有4%的MV形成，但早期和晚期病毒蛋白可以產(chǎn)生如同在允許細(xì)胞中一樣產(chǎn)生[18-20]。至于其機(jī)制，報(bào)告稱在人和鼠細(xì)胞中病毒宿主范圍因子C7或K1對(duì)MVA晚期基因的表達(dá)是必不可少的[7]。具體來(lái)說(shuō)，痘苗病毒感染可以引起真核翻譯起始因子2α（eIF2α）的磷酸化，從而抑制細(xì)胞和病毒蛋白合成，而痘苗病毒已進(jìn)化出對(duì)抗這種抗病毒反應(yīng)的能力。該研究揭示，在MVA感染的幾種人和鼠細(xì)胞系中，宿主范圍基因K1L和C7L均能抑制eIF2α的磷酸化，而C7L刪除的MVA（MVA-ΔC7L）缺乏晚期基因的表達(dá)，且這一現(xiàn)象可被宿主范圍因子K1或C7的功能拯救。

表1 MVA、NYVAC和NTV的對(duì)幾種細(xì)胞的嗜性

C7L和K1L均缺失的NYVAC的復(fù)制缺陷可能是由于晚期病毒蛋白合成的抑制。一項(xiàng)關(guān)于MVA和NYVAC在非允許和允許培養(yǎng)細(xì)胞中同等條件下的對(duì)比研究顯示，以5 PFU/細(xì)胞的MVA或NYVAC感染HeLa細(xì)胞16 h后的電鏡照片上，NYVAC感染的細(xì)胞胞漿中IV的數(shù)量明顯少于MVA感染的細(xì)胞，說(shuō)明NYVAC形態(tài)發(fā)生的阻斷同時(shí)或先于IV的形成，即在NYVAC感染的細(xì)胞中存在翻譯阻斷[6]。其機(jī)制是翻譯起始因子eIF2α磷酸化水平的升高影響了某些病毒粒子成熟需要的晚期病毒蛋白的合成，也可能與NYVAC在感染的HeLa細(xì)胞中引發(fā)的強(qiáng)有力的凋亡有關(guān)。

此外，關(guān)于MVA和NYVAC的基因表達(dá)譜的比較性研究通過(guò)對(duì)超過(guò)15 000個(gè)人類基因進(jìn)行cDNA微陣列掃描發(fā)現(xiàn)，在MVA和NYVAC感染的HeLa細(xì)胞中，宿主基因的表達(dá)有差異[21-22]，可能也會(huì)影響病毒成熟的程度。

初步研究表明NTV在具有復(fù)制缺陷特點(diǎn)的同時(shí)，保留了與原天壇株痘苗病毒相近的DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)能力[5]。具體來(lái)說(shuō)，痘苗病毒P11晚期啟動(dòng)子下的乙肝病毒SS1基因的表達(dá)水平在NTV重組病毒（VHFIL2ΔCKSS1）和原復(fù)制型天壇株重組病毒（VHFIL2SS1）之間均無(wú)明顯差別。至于NTV具體在生活周期的哪一步受阻，尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。非常有趣的是，NTV中C7L和K1L基因均缺失，卻能完成P11晚期啟動(dòng)子下的外源基因表達(dá)，似乎與上述MVA的研究結(jié)果不一致。

4 病毒在組織中的分布

觀察病毒是否可以在特異性的組織或器官中復(fù)制和擴(kuò)散，可以反映病毒的組織或器官嗜性，進(jìn)而決定病毒是否能在特定種屬中傳播并產(chǎn)生致病性。影響病毒組織嗜性的因素包括影響細(xì)胞嗜性的因子（如宿主范圍基因）和組織特異性的抗病毒免疫反應(yīng)，這些因素共同決定病毒在特定組織或器官中的擴(kuò)散能力和分布[12]。與具有完全復(fù)制能力的痘苗病毒W(wǎng)R株相比，MVA、NYVAC和NTV減毒株不能在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生子代病毒，因此，明確這些病毒在體內(nèi)的分布和病毒編碼基因在不同組織中表達(dá)的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)非常重要。

痘病毒，特別是痘苗病毒，可通過(guò)幾種方式在宿主中傳播，即通過(guò)肌動(dòng)蛋白直接在細(xì)胞間傳播、作為自由的病毒傳播、感染白細(xì)胞和/或通過(guò)病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)傳播。其中，MV和EV是2種最主要的感染病毒形式，MV在數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（＞EV100倍），對(duì)病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖起重要作用，但MV形式僅在晚期細(xì)胞死亡和包膜破裂后才能傳播到遠(yuǎn)處，而EV則介導(dǎo)病毒的細(xì)胞間擴(kuò)散和遠(yuǎn)程感染，因而對(duì)病毒體內(nèi)的感染和增殖起重要作用。WV和CEV是介于MV和EV之間的另2種中間形式的病毒，它們對(duì)EV的形成至關(guān)重要。此外，CEV可以通過(guò)細(xì)胞和細(xì)胞的接觸而直接感染臨近細(xì)胞，因而對(duì)病毒在接觸細(xì)胞中的擴(kuò)散起重要作用[13,23-26]。

一項(xiàng)關(guān)于MVA和NYVAC的體內(nèi)比較性研究通過(guò)生物發(fā)光成像法和生化分析測(cè)定重組病毒表達(dá)的螢光素酶基因[27]。該研究表明，與WR相比，MVA和NYVAC感染細(xì)胞中熒光信號(hào)的表達(dá)都很短暫，表明它們?cè)隗w內(nèi)受限復(fù)制的特性；二者在腹膜內(nèi)接種后都能到達(dá)并感染接種部位以外的靶組織；2種載體表達(dá)的異種抗原在NYVAC感染后比MVA感染后在小鼠體內(nèi)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)；但是，在感染后短期內(nèi)MVA比NYVAC的基因表達(dá)效率高，推測(cè)這種差異并不是由于病毒吸附，而是由病毒進(jìn)入后發(fā)生的時(shí)間造成。另一項(xiàng)最近的恒河猴實(shí)驗(yàn)表明，霧化和放射標(biāo)記的表達(dá)HIV和HPV抗原的重組MVA和NYVAC抗原產(chǎn)生至少長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的安全和成功的針對(duì)外源抗原的免疫應(yīng)答。另外，對(duì)恒河猴模型的閃爍掃描成像結(jié)果顯示，病毒可被肺和呼吸道的黏膜組織吸收，卻不會(huì)感染腦和眼。這些研究提示，全身和黏膜途徑是MVA和NYVAC安全高效的免疫接種途徑[28]。

一項(xiàng)最新的小鼠活體成像法研究NTV的組織分布發(fā)現(xiàn)，肌肉和皮內(nèi)途徑感染的NTV-Fluc均局限分布于感染部位，未出現(xiàn)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[29]。

5 病毒-宿主細(xì)胞間的相互作用

盡管MVA、NYVAC和NTV載體有能夠產(chǎn)生與具有完全復(fù)制能力的痘苗病毒相同水平的重組抗原以及通過(guò)全身和黏膜途徑誘發(fā)對(duì)抗多種感染性疾病的有效的特異性免疫反應(yīng)的能力[3,5,30-36]，僅有少數(shù)研究在相同條件下對(duì)比了基于這些毒株的重組體引發(fā)的免疫反應(yīng)。

研究表明，表達(dá)HIV-1抗原的MVA和NYVAC可誘發(fā)強(qiáng)有力的針對(duì)外源抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)，但這種反應(yīng)的廣度和寬度因痘病毒載體不同而異，還受方法和所用動(dòng)物模型的影響[37-38]。在NTV、MVA和NYVAC減毒株的產(chǎn)生過(guò)程中，一些免疫調(diào)節(jié)基因被刪除或被破壞，這或許能夠解釋為何三者的復(fù)制雖然受到限制，但卻保留了較好的免疫原性。MVA比NYVAC丟失了更多的免疫調(diào)節(jié)基因，這與二者在體內(nèi)誘導(dǎo)出炎癥反應(yīng)的時(shí)機(jī)和強(qiáng)度一致。比如，MVA比NYVAC傳播和誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)要快，但也被快速清除（48 h后），然而NYVAC載體可誘發(fā)延遲的抗病毒反應(yīng)，且在感染動(dòng)物組織中保持的時(shí)間比MVA長(zhǎng)24 h[27]。另一項(xiàng)更深入的MVA和NYVAC載體的比較研究表明，MVA載體在誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞反應(yīng)的同時(shí)，更傾向于誘導(dǎo)特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，而NYVAC載體比MVA更能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞反應(yīng)[39]。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了MVA和NYVAC引發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)的差異，而這些差異可能會(huì)影響疫苗的效力。MVA和NYVAC之間的另一個(gè)顯著區(qū)別是感染不成熟的人單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞（mDC）后調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的能力[40]。與未感染的mDC相比，這些載體對(duì)于宿主基因的表達(dá)有很大的影響：二者都能上調(diào)195個(gè)相同的基因，同時(shí)MVA還上調(diào)另外359個(gè)基因，而NYVAC上調(diào)另外165個(gè)基因。在mRNA水平，雖然二者都上調(diào)IL-12、IFN-β和TNF-α，但它們被MVA上調(diào)的水平更高，且MVA感染會(huì)選擇性地誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素、IL-6和Toll樣受體通路。值得注意的是，在NYVAC感染的mDC中，CD8+T細(xì)胞刺激基因顯著降低。另外，NYVAC在體內(nèi)更長(zhǎng)期的基因表達(dá)可能會(huì)影響載體誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞反應(yīng)的傾向，因?yàn)橛袌?bào)道說(shuō)，推動(dòng)這個(gè)T細(xì)胞亞群的克隆擴(kuò)增和分化需要在整個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增期都有抗原持續(xù)存在[41]。

關(guān)于NTV的相關(guān)研究不多。有報(bào)道說(shuō)，NTV疫苗免疫小鼠后能檢測(cè)到高水平的IFN-γ分泌，并能引起小鼠外周血中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)和白細(xì)胞總數(shù)增加，脾臟重量增加，還能引起注射部位肌肉、骨神經(jīng)及肌肉的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生及腹股溝淋巴結(jié)生發(fā)中心易染體巨噬細(xì)胞增多[42]。

6 結(jié)語(yǔ)

以上介紹了NTV、MVA和NYVAC的幾個(gè)主要生物學(xué)性狀。不難發(fā)現(xiàn)，目前關(guān)于非復(fù)制型痘苗病毒MVA和NYVAC的生物學(xué)性狀的比較性研究較為深入，而關(guān)于我國(guó)NTV的生物學(xué)性狀的研究較少，然而對(duì)這些病毒生物學(xué)性狀的探討對(duì)于今后基于這些病毒的重組疫苗的開(kāi)發(fā)有重要意義。比如，研究NYVAC的體外生長(zhǎng)特性發(fā)現(xiàn)，NYVAC感染后的細(xì)胞在晚期有凋亡的跡象，可能對(duì)病毒的復(fù)制和形態(tài)發(fā)生有重要影響，及它會(huì)影響NYVAC晚期蛋白翻譯和隨后IV的形成。換言之，影響作為抗原的病毒晚期蛋白的表達(dá)，同時(shí)影響宿主細(xì)胞MHC分子的表達(dá)，進(jìn)而影響抗原呈遞效率，這可能對(duì)基于NYVAC的重組疫苗特別是腫瘤疫苗誘發(fā)有效的免疫反應(yīng)十分不利。另一個(gè)例子，研究MVA、NYVAC和NTV感染細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，這些病毒產(chǎn)生的細(xì)胞病變效應(yīng)明顯弱于具有完全復(fù)制能力的毒株，從安全性的角度講這是有利的，但在腫瘤治療性疫苗的研究中，病毒感染后破壞宿主細(xì)胞會(huì)促進(jìn)腫瘤抗原的釋放，因此，可能需要研究如何克服腫瘤抗原釋放問(wèn)題的方法。第三個(gè)例子是通過(guò)研究以不同途徑接種的MVA和NYVAC在組織中的分布情況，可以找到安全有效的接種途徑，事實(shí)上，還能進(jìn)一步對(duì)動(dòng)物模型中的給藥劑量、誘發(fā)的免疫反應(yīng)類型和持續(xù)時(shí)間進(jìn)行探索。第四個(gè)例子是發(fā)現(xiàn)MVA傾向于促進(jìn)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，我們就可以根據(jù)不同類型疫苗（比如預(yù)防性疫苗和治療性疫苗）研發(fā)的需要選擇合適的載體。

關(guān)于NTV的生物學(xué)性狀在很多方面還有大量的工作可以做，比如NTV的體外生長(zhǎng)特性的研究，NTV的復(fù)制和形態(tài)發(fā)生的研究（包括NTV的晚期病毒蛋白表達(dá)機(jī)制以及與C7L和K1L的關(guān)系，NTV具體在生活周期的哪一步被阻斷），通過(guò)人工選擇突變研究NTV的生物學(xué)性狀與可能對(duì)應(yīng)的功能基因的關(guān)系，NTV與其他非復(fù)制型痘苗病毒在組織中分布的比較，以及NTV和宿主細(xì)胞的相互作用誘發(fā)的免疫反應(yīng)和機(jī)理的研究等。正如前言中所說(shuō)，以非復(fù)制型痘苗病毒為載體的重組疫苗在反恐和腫瘤治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，我們相信，對(duì)NTV生物學(xué)性狀的深入研究必定會(huì)促進(jìn)基于NTV的針對(duì)多種感染性疾病和多種腫瘤的重組疫苗研發(fā)。

[1]Gomez C E,Najera G J,Krupa M,et al，MVA and NYVAC as vaccines against emergent infectious diseases and cancer[J].Curr Gene Ther,2011,11(3):189-217.

[2] Pastoret P P,Vanderplasschen A.Poxviruses as vaccine vec?tors[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,2003,26(5-6):343-355.

[3] Sutter G,Staib C.Vaccinia vectors as candidate vaccines:the development of modified vaccinia virus Ankara for antigen de?livery[J].Curr Drug Targets Infect Disord,2003,3(3):263-271.

[4] Tartaglia J,Perkus M E,Taylor J,et al.NYVAC:a highly at?tenuated strain of vaccinia virus[J].Virology,1992,188(1):217-232.

[5] 阮力,朱既明,婁元梅,等.復(fù)制缺陷型天壇株痘苗病毒[P].中國(guó)專利，200610056800.0,2008-06-11.

[6] Najera J L,Gomez C E,Domingo-Gil E,et al.Cellular and biochemical differences between two attenuated poxvirus vac?cine candidates(MVA and NYVAC)and role of the C7L gene[J].J Virol,2006,80(12):6033-6047.

[7] Backes S,Sperling K M,Zwilling J,et al.Viral host-range factor C7 or K1 is essential for modified vaccinia virus Anka?ra late gene expression in human and murine cells,irrespec?tive of their capacity to inhibit protein kinase R-mediated phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha[J].J Gen Virol,2010,91(Pt 2):470-482.

[8] Willis K L,Patel S,Xiang Y,et al.,The effect of the vaccin?ia K1 protein on the PKR-eIF2alpha pathway in RK13 and HeLa cells[J].Virology,2009,394(1):73-81.

[9] Willis K L,Langland J O,Shisler J L.Viral double-stranded RNAs from vaccinia virus early or intermediate gene tran?scripts possess PKR activating function,resulting in NF-kap?paB activation,when the K1 protein is absent or mutated[J].J Biol Chem,2011,286(10):7765-7778.

[10]Meng X,Jiang C,Arsenio J,et al.Vaccinia virus K1L and C7L inhibit antiviral activities induced by type I interferons[J].J Virol,2009,83(20):10627-10636.

[11]金奇,陳南海,陳淑霞,等.痘苗病毒天壇株全基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的分析[J].中國(guó)科學(xué)（C輯）,1997,27(6):562-567.

[12]McFadden G.Poxvirus tropism[J].Nat Rev Microbiol,2005,3(3):201-213.

[13]Appleyard G,Hapel A J,Boulter A E.An antigenic differ?ence between intracellular and extracellular rabbitpox virus[J].J Gen Virol,1971,13(1):9-17.

[14]Meyer H,Sutter G,Mayr A.Mapping of deletions in the ge?nome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence[J].J Gen Virol,1991,72(Pt5):1031-1038.

[15]Moss B,Shisler J L.Immunology 101 at poxvirus U:immune evasion genes[J].Semin Immunol,2001,13(1):59-66.

[16]Broyles S S.Vaccinia virus transcription[J].J Gen Virol,2003,84(Pt 9):2293-2303.

[17]Moss B. Poxvirus entry and membrane fusion[J]. Virology,2006,344(1):48-54.

[18]Sutter G,Moss B.Nonreplicating vaccinia vector efficiently ex?presses recombinant genes[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992.89(22):10847-10851.

[19]Sancho M C,Schleich S,Griffiths G,et al.The block in as?sembly of modified vaccinia virus Ankara in HeLa cells re?veals new insights into vaccinia virus morphogenesis[J].J Vi?rol,2002,76(16):8318-8334.

[20]Gallego-Gomez J C,Risco C,Rodriguez D,et al.Differences in virus-induced cell morphology and in virus maturation be?tween MVA and other strains(WR,Ankara,and NYCBH)of vaccinia virus in infected human cells[J].J Virol,2003,77(19):10606-10622.

[21]Guerra S,Lopez-Fernandez L A,Pascual-Montano A,et al.Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC:up?regulation ofapoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells[J].J Virol,2006,80(2):985-998.

[22]Guerra S,Lopez-Fernandez L A,Conde R,et al.Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene ex?pression in response to attenuated modified vaccinia virus An?kara infection of human HeLa cells[J].J Virol,2004,78(11):5820-5834.

[23]Boulter E A,Appleyard G.Differences between extracellular and intracellular forms of poxvirus and their implications[J].Prog Med Virol,1973,16:86-108.

[24]Payne L G.Significance of extracellular enveloped virus in the in vitro and in vivo dissemination of vaccinia[J].J Gen Virol,1980,50(1):89-100.

[25]Payne L G,Kristensson K.Extracellular release of enveloped vaccinia virus from mouse nasal epithelial cells in vivo[J].J Gen Virol,1985,66(Pt 3):643-646.

[26]方清.痘苗病毒天壇株生物學(xué)特性研究及其基因工程減毒載體的構(gòu)建[D].武漢:武漢大學(xué),2005.

[27]Gomez C E,Najera J L,Domingo-Gil E,et al.Virus distribu?tion of the attenuated MVA and NYVAC poxvirus strains in mice[J].J Gen Virol,2007,88(Pt 9):2473-2478.

[28]Corbett M,Bogers W M,Heeney J L,et al.Aerosol immuni?zation with NYVAC and MVA vectored vaccines is safe,sim?ple,and immunogenic[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(6):2046-2051.

[29]劉強(qiáng),齊香榮,朱蓉,等.利用活體成像術(shù)對(duì)痘苗病毒小鼠體內(nèi)生物分布和表達(dá)的研究[J].中國(guó)病毒病雜志,2013,3(4)274-279.

[30]馬海倫,孫朝暉,陸柔劍,等.同時(shí)表達(dá)多種外源基因的非復(fù)制型重組痘苗病毒的構(gòu)建[J].病毒學(xué)報(bào),1999,15(1):21-28.

[31]馬海倫,郭斐,孫朝暉,等.非復(fù)制型多價(jià)重組痘苗病毒粘膜與細(xì)胞免疫效果[J].病毒學(xué)報(bào),1999,15(1):14-20.

[32]Drexler I,Staib C,Sutter G.Modified vaccinia virus Ankara as antigen delivery system:how can we best use its potential[J]?Curr Opin Biotechnol,2004,15(6):506-512.

[33]Paoletti E.Applications of pox virus vectors to vaccination:an update[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(21):11349-11353.

[34]Tartaglia J,Cox W I,Pincus S,et al.Safety and immunoge?nicityofrecombinantsbased on thegenetically-engineered vaccinia strain,NYVAC[J].Dev Biol Stand,1994,82:125-129.

[35]Gherardi M M,Esteban M.Recombinant poxviruses as muco?sal vaccine vectors[J].J Gen Virol,2005,86(Pt 11):2925-2936.

[36]Franchini G,Gurunathan S,Baglyos L,et al.Poxvirus-based vaccine candidates for HIV:two decades of experience with special emphasis on canarypox vectors[J].Expert RevVac?cines,2004,3(4 Suppl):S75-88.

[37]Gomez C E,Najera J L,Jimenez E P,et al.Head-to-head comparison on the immunogenicity of two HIV/AIDS vaccine candidates based on the attenuated poxvirus strains MVA and NYVAC co-expressinginasinglelocustheHIV-1BX08 gp120 and HIV-1(IIIB)Gag-Pol-Nef proteins of clade B[J].Vaccine,2007,25(15):2863-2885.

[38]Gomez C E,Najera J L,Jimenez V,et al.Generation and im?munogenicity of novel HIV/AIDS vaccine candidates targeting HIV-1Env/Gag-Pol-NefantigensofcladeC[J].Vaccine,2007,25(11):1969-1992.

[39]Mooij P,Balla-Jhagjhoorsingh S S,Koopman G,et al.Differ?ential CD4+versus CD8+T-cell responses elicited by differ?ent poxvirus-based human immunodeficiency virus type 1 vac?cine candidates provide comparable efficacies in primates[J].J Virol,2008,82(6):2975-2988.

[40]Guerra S,Najera J L,Gonzalez J M,et al.Distinct gene ex?pression profiling after infection of immature human monocytederived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC[J].J Virol,2007,81(16):8707-8721.

[41]Obst R,van Santen H M,Mathis D,et al.Antigen persis?tence is required throughout the expansion phase of a CD4+T cell response[J].J Exp Med,2005,201(10):1555-1565.

[42]劉麗,沈連忠,林志,等.復(fù)制缺陷型天壇株痘苗病毒天花疫苗安全性評(píng)價(jià)[C]//中國(guó)毒理學(xué)會(huì)第三屆中青年學(xué)者科技論壇暨2011年全國(guó)前列腺藥理毒理學(xué)研討會(huì).2011.