賈全棟，劉學勝，郭燕風，徐建中，張偉國

(江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122)

丁二酸又稱琥珀酸、二元羧酸，其作為C4平臺化合物，在食品、醫(yī)藥、表面活性劑、洗滌劑、綠色溶劑、生物可降解塑料和動植物生長刺激物等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景［1］?；瘜W法生產(chǎn)丁二酸成本高，對環(huán)境污染嚴重［2］，抑制了其作為大宗化學品的發(fā)展?jié)摿?生物法生產(chǎn)丁二酸具有低成本、污染小的優(yōu)點，越來越受到人們的重視［3］。

谷氨酸棒狀桿菌是一種生長快、好氧和不產(chǎn)芽胞的革蘭氏陽性微生物。在O2充足條件下，以葡萄糖為原料，發(fā)酵生產(chǎn)各種氨基酸［4－5］;在厭氧條件下，谷氨酸棒狀桿菌不生長，但可以轉(zhuǎn)化葡萄糖為乳酸、丁二酸和乙酸等物質(zhì)［6－7］。谷氨酸棒狀桿菌生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)丁二酸，主要是通過三羧酸循環(huán)途徑(TCA)的還原支路，將糖酵解途徑(EMP)中得到的磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸經(jīng)過一步CO2固定和兩步還原反應(yīng)生成丁二酸，該過程涉及的關(guān)鍵酶主要有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、延胡索酸酶和琥珀酸脫氫酶［8］。

本文中，筆者研究溫度和NaHCO3等環(huán)境條件對谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032Δldh產(chǎn)丁二酸的影響，通過代謝流分析比較原始菌株谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032與ATCC13032Δldh在厭氧條件下的代謝流分布情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032和谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032Δldh(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室構(gòu)建并保藏)。

1.1.2 主要試劑及儀器

葡萄糖(食品級)，山東西王集團;玉米漿，濰坊金玉米有限公司;高效液相色譜儀，美國Dionex公司;SBA-40C生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所;冷凍離心機，美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖25，玉米漿30，尿素6.0，K2HPO4·3H2O 2.0，MgSO4·7H2O 0.6;pH 7.2。0.1 MPa滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 70，KH2P041.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.6，MnSO4·4H2O 0.02，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，VB10.000 2，VH0.000 2;pH 6.5。0.07 MPa滅菌10 min，發(fā)酵過程中間歇性補加NaHCO3。

1.2.2 培養(yǎng)方法

種子液培養(yǎng)方法:挑取活化后的菌種接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在31℃、100 r/min條件下培養(yǎng)10 h。

將種子液離心(6 000 r/min、4 ℃、10 min)，收集菌體，然后用發(fā)酵培養(yǎng)基將菌體重新懸浮成菌懸液;干菌體質(zhì)量濃度40 g/L，將菌懸液接種到31℃有蓋子的瓶子中厭氧轉(zhuǎn)化36 h，轉(zhuǎn)化過程間歇性補加NaHCO3。

1.2.3 菌體生長曲線測定

將樣品用蒸餾水稀釋26倍，在610 nm波長下測量吸光度(A610)。

1.2.4 菌體干質(zhì)量測定

稱出100 mL離心管的質(zhì)量(m1)，取50 mL種子液置于離心管中，6 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗滌2次，于105℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量(m2)，菌體干質(zhì)量 =m2－m1。

1.2.5 樣品處理

發(fā)酵結(jié)束后，收集發(fā)酵液6 000 r/min離心，上清液用蒸餾水稀釋10倍后用于有機酸含量測定。

1.2.6 葡萄糖、有機酸含量的測定

葡萄糖含量利用SBA-40C生物傳感反應(yīng)儀(山東省科學院生物研究所)測定;有機酸含量測定［9］:采用高效液相色譜法(戴安Dionex P680系列)，色譜柱為COSMOSIL反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為體積分數(shù)0.5%乙腈－20 mmol/L KH2PO4溶液，pH 2.5，流速 0.5 mL/min，進樣體積10 μL，柱溫25℃，紫外檢測器檢測，檢測波長為210 nm。

1.2.7 谷氨酸棒狀桿菌厭氧產(chǎn)酸代謝流分析方法

代謝流分析(MFA)是代謝工程中用以指導遺傳操作的重要工具，是代謝網(wǎng)絡(luò)定量分析的基本方法之一［10］。MFA根據(jù)胞內(nèi)主要反應(yīng)構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)模型和胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的質(zhì)量平衡來計算物質(zhì)代謝流分布情況，對于理解細胞的代謝調(diào)控機制具有重要意義。根據(jù)文獻［11］以及發(fā)酵實驗分析，建立了谷氨酸棒狀桿菌以葡萄糖為C源，在厭氧條件下合成丁二酸的代謝網(wǎng)絡(luò)，如圖1所示。主要包括糖酵解途徑、部分TCA途徑、C3、C4的合成途徑。代謝流平衡模型的建立:代謝節(jié)點處反應(yīng)速率方程見表1。方程組由4個方程構(gòu)成，8個未知數(shù)，通過測定厭氧轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率確定代謝網(wǎng)絡(luò)流量分配，在谷氨酸棒狀桿菌厭氧轉(zhuǎn)化前期(0～6 h)離線測定葡萄糖、乳酸、丁二酸和乙酸的濃度。在谷氨酸棒狀桿菌厭氧代謝過程中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶對CO2的固定起主要作用，占有主導地位，丙酮酸羧化酶的敲除對菌株產(chǎn)生丁二酸沒有影響［12］，因此以J6=0，作為已知參量，代入上述代謝速率平衡方程組，通過以上數(shù)據(jù)可以計算代謝流分布。在代謝流的計算中，均以100 mmol/(L·h)的葡萄糖為計算基準，所有代謝流量的單位均為mmol/(L·h)。

基于以下原則建立代謝網(wǎng)絡(luò)［13］:①代謝流分析是基于擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)基礎(chǔ)上的分析方法;②反應(yīng)途徑中消耗的NADH與代謝產(chǎn)生的NADH總數(shù)相等，即NADH供需平衡;③忽略乙醛酸循環(huán)，不考慮EMP途徑;④按固定比例進行的反應(yīng)及無分支點的中間反應(yīng)，盡量簡化為一個反應(yīng)方程;⑤細胞生長停滯階段，由于大量無效循環(huán)的存在，所以不考慮ATP總量的平衡。

圖1 谷氨酸棒狀桿菌厭氧代謝流量分布Fig.1 Metabolic flux distribution of C.glutamicum under anaerobic condition

表1 代謝節(jié)點反應(yīng)速率方程Table 1 Reaction rate equation of metabolic nodes

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸脫氫酶基因敲除對谷氨酸棒狀桿菌生長的影響

測定菌株的生長曲線，每2 h取樣，繪制生長曲線，見圖2。由圖2可知，菌株ATCC13032Δldh和原始菌株進入對數(shù)生長期和穩(wěn)定期時間是一致的，但最終敲除菌的生物量比原始菌明顯減少，說明乳酸脫氫酶基因的敲除對菌株生長上有一定的負面影響。

圖2 谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032及其突變株ATCC13032Δldh的生長曲線Fig.2 Growth curves of C.glutamicum ATCC13032 and C.glutamicum ATCC13032Δldh

2.2 碳酸鹽對丁二酸產(chǎn)量的影響

在谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032Δldh轉(zhuǎn)化葡萄糖產(chǎn)丁二酸過程中，主要通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶固定CO2生成丁二酸的前體物質(zhì)草酰乙酸。碳酸鹽對丁二酸產(chǎn)量的影響見圖3。由圖3可知:在pH 8.0條件下，發(fā)現(xiàn)補加NaHCO3的效果最好，丁二酸產(chǎn)量為33.2 g/L;而補加CaCO3和Na2CO3，丁二酸產(chǎn)量很低。

圖3 碳酸鹽對丁二酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different kinds of carbonates on succinic acid production by C.glutamicum ATCC13032Δldh

2.3 NaHCO3質(zhì)量濃度對厭氧轉(zhuǎn)化的影響

NaHCO3作為CO2的來源，對于丁二酸厭氧轉(zhuǎn)化非常重要［14］?？疾霳aHCO3的添加量對代謝的影響，一次性添加不同質(zhì)量濃度(0、10、20、30、40 和50 g/L)NaHCO3，初始pH 8.0，厭氧轉(zhuǎn)化20 h，結(jié)果如表2所示。

由表2可知:NaHCO3的濃度影響葡萄糖轉(zhuǎn)化速率，在0～50 g/L的范圍內(nèi)，NaHCO3的濃度越高，葡萄糖的轉(zhuǎn)化速率越快;NaHCO3的濃度也影響代謝流的分布，NaHCO3濃度低時，代謝流較多流向丙酮酸，轉(zhuǎn)化為大量乙酸。隨著NaHCO3濃度的提高，流向丁二酸的代謝流增加，NaHCO3濃度的增加使葡萄糖更多地轉(zhuǎn)化為丁二酸，丁二酸與乙酸的摩爾比增加。但是添加50 g/L NaHCO3，丁二酸濃度降低，丁二酸與乙酸的摩爾比也有所降低，說明過高的NaHCO3對菌體轉(zhuǎn)化造成抑制，NaHCO3不僅是丁二酸的合成來源，也是影響厭氧代謝流向的重要因素，因此在厭氧轉(zhuǎn)化過程中必須合理補加NaHCO3。

表2 NaHCO3濃度對厭氧代謝的影響Table 2 Effects of bicarbonate on Anaerobic metabolism by C.glutamicum ATCC13032Δldh

2.4 溫度對厭氧轉(zhuǎn)化的影響

微生物的產(chǎn)物合成需要在合適的溫度下進行，溫度對微生物的影響是多方面的，如酶活、傳質(zhì)等方面。溫度對發(fā)酵的影響是各種因素綜合變化的結(jié)果，因此在發(fā)酵過程中必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境［15］。筆者考察溫度對丁二酸轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知:隨著溫度的升高，丁二酸質(zhì)量濃度不斷增加，當溫度達到33℃后，再升高溫度，丁二酸質(zhì)量濃度反而有所下降。所以，選取33℃作為丁二酸發(fā)酵的最佳溫度。

圖4 溫度對丁二酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of temperature on succinic acid production by C.glutamicum ATCC13032Δldh

2.5 代謝流分析

代謝流分析可以直觀地反映不同途徑的相互作用以及圍繞代謝分支點的物質(zhì)流分布，進而表征細胞的代謝能力［16］。通過研究谷氨酸棒狀桿菌厭氧代謝轉(zhuǎn)化葡萄糖前期的代謝流，分析乳酸脫氫酶基因敲除對代謝流分布的影響。對厭氧轉(zhuǎn)化前期(0～6 h)代謝流量進行分析，選擇0和6 h離線測定葡萄糖、丁二酸、乙酸和乳酸的濃度。代謝流量分布情況如圖5所示。

圖5 谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032與ATCC13032Δldh厭氧代謝流量分布比較Fig.5 Comparison of metabolic flux distribution between C.glutamicum ATCC13032 and ATCC13032Δldh

從圖5可以看出:乳酸脫氫酶基因的敲除對谷氨酸棒狀桿菌的代謝流有很大影響，流向乳酸的代謝流變?yōu)?，流向丁二酸的代謝流大幅提高，乳酸脫氫酶基因敲除導致PEP生成丁二酸的代謝流增加了214.3%。PEP和Pyr是代謝流中的關(guān)鍵節(jié)點，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶將PEP轉(zhuǎn)化為丁二酸，流向丙酮酸的代謝流轉(zhuǎn)化為乙酸。乳酸脫氫酶基因敲除導致流向乳酸的代謝流為0，經(jīng)過酶活測定谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032Δldh的乳酸脫氫酶活性為0(數(shù)據(jù)未顯示)，說明谷氨酸棒狀桿菌在厭氧條件下沒有其他的途徑產(chǎn)生乳酸，乳酸脫氫酶沒有其他的同工酶。

2.6 分批發(fā)酵實驗結(jié)果

通過實驗對谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032Δldh厭氧轉(zhuǎn)化過程進行分析，添加90 g/L葡萄糖的發(fā)酵液，干菌體質(zhì)量濃度40 g/L，溫度33℃，500 mL厭氧瓶裝液100 mL，轉(zhuǎn)化過程中取樣分析葡萄糖和有機酸濃度變化，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知:經(jīng)過36 h的厭氧轉(zhuǎn)化，丁二酸質(zhì)量濃度41.2 g/L，轉(zhuǎn)化率達到45.0%，產(chǎn)酸速率1.14 g/(L·h)，較原始菌株有大幅提高。

圖6 谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032Δldh厭氧分批轉(zhuǎn)化過程曲線Fig.6 Batch bioconversion curves of organic acid production under oxygen deprivation conditions

3 結(jié)論

谷氨酸棒狀桿菌厭氧轉(zhuǎn)化葡萄糖產(chǎn)丁二酸過程中，補加NaHCO3，丁二酸的產(chǎn)量最高。NaHCO3不僅影響葡萄糖轉(zhuǎn)化速率和丁二酸生成速率，而且影響丁二酸與乙酸生成的摩爾比。最佳轉(zhuǎn)化溫度是33℃。乳酸脫氫酶基因敲除對谷氨酸棒狀桿菌代謝流分布有很大影響，流向丁二酸的代謝流提高了214.3%，流向乳酸的代謝流為0。在以上條件控制下谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032Δldh分批轉(zhuǎn)化36 h，產(chǎn)丁二酸41.2 g/L，轉(zhuǎn)化率45.0%，較原始菌株有很大提高。

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