宋 波，侯怡鈴，丁 祥

(西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南充 637002)

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一類在環(huán)境中廣泛分布的有機(jī)污染物，其性質(zhì)穩(wěn)定、殘留時(shí)間長，是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的化學(xué)致癌物［1］，已被多個(gè)國家列為優(yōu)先控制污染物。PAHs在環(huán)境中普遍存在，具有致誘變性，而且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難以降解等特點(diǎn)。目前，治理PAHs污染的方法主要以生物修復(fù)為技術(shù)。以微生物代謝作用為主的生物修復(fù)技術(shù)具有成本低、效果好、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是目前PAHs污染土壤修復(fù)最具有潛力的修復(fù)手段之一［2－3］。但是采用傳統(tǒng)的微生物降解手段耗時(shí)較長，借助外加電場等技術(shù)加速菲的降解顯得尤為重要［4－5］。

對微生物細(xì)胞施加外加電場如弱電流在液相或泥漿體系中激發(fā)電極反應(yīng)能刺激微生物的生長和代謝作用［6］，已成功應(yīng)用于酵母菌的發(fā)酵［7］、生物脫氮［8］以及鐵細(xì)菌［9］電化學(xué)培養(yǎng)等過程。微生物電解技術(shù)是電化學(xué)與生物工程交叉領(lǐng)域的一個(gè)重要課題，近年來受到研究者日益增長的關(guān)注。目前該技術(shù)已在工業(yè)微生物培養(yǎng)和環(huán)境微生物電刺激修復(fù)［7－8］兩方面顯示出良好的前景，為未來利用外加電場強(qiáng)化于微生物反應(yīng)的生物化工及環(huán)境化工過程提供了一個(gè)新的趨勢。鑒于此，筆者以從石油污染土壤分離得到的細(xì)菌Enterobacter dissolvens為實(shí)驗(yàn)對象，以菲為唯一C源，由于菲在水中的溶解度較低，通過添加吐溫80促溶，使菲在水中的溶解度有明顯的提高［10］。綜合考察在外加電場下，利用直流電(DC)和交流電(IC)條件下，該細(xì)菌在生長、活性以及菲的降解率等方面的影響，旨在為利用微生物修復(fù)土壤環(huán)境中多環(huán)芳烴污染提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

所用的菌種篩選自天津大港油田油污染水中，并以菲為唯一C源進(jìn)行馴化。經(jīng)16s rDNA測序后鑒定該菌為Enterobacter dissolvens屬革蘭氏陰性腸桿菌。

1.2 培養(yǎng)基

采用無機(jī)鹽類(g/L):MgSO40.25、FeSO4·7H2O 0.01、CaCl20.032、K2HPO40.8、KH2PO40.2、NH4NO30.8;由于菲難溶，故添加吐溫80作為增溶劑，質(zhì)量濃度分別為3.2和1 000 mg/L。

1.3 預(yù)培養(yǎng)條件

參考Luo等［11］報(bào)道電刺激多采用對數(shù)期的細(xì)菌作為研究對象，首先對細(xì)菌溶液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以保持細(xì)菌液具有較高的活性。預(yù)培養(yǎng)條件:首先從－80℃低溫冰箱中保存的甘油管中取出0.1 mL種子菌液，接種至盛有50 mL經(jīng)過濾滅菌含培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃恒溫?fù)u床(150 r/min)中培養(yǎng)約10 h，此時(shí)所得的細(xì)菌的生長處于對數(shù)生長期初期，菌體濃度(OD600)在0.2至0.3之間。

1.4 分析方法

1.4.1 細(xì)菌濃度測定

測量600 nm波長處的吸光度值(OD600)。

1.4.2 細(xì)胞脫氫酶活測定

采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)顯色法測定細(xì)胞脫氫酶活［12］。

1.4.3 氧化還原電位測定

采用 Pt4865-50-S7，氧化還原電極(Mettler Toledo公司)測定氧化還原電位(ORP)。

1.4.4 菲的測定

由于菲不溶于水，采用正己烷將溶液中的菲萃出。萃取出液相時(shí)，1 mL樣品溶液中加入1mL正己烷，劇烈振蕩1 min后離心，取上層有機(jī)相。采用Shimadu LC-10AT(Shimadu公司)高壓液相色譜配合C18反相柱測定有機(jī)相中菲的濃度。檢測方法為紫外法(UV)，檢測波長為254 nm，流動相為甲醇-水溶液(兩者體積比為 90∶10)，流速 180 mL/min。采用外標(biāo)法測定菲的濃度。

1.4.5 吐溫80的分析

采用硫氫酸銨鈷顯色法測定吐溫80［13］。

1.5 電解刺激實(shí)驗(yàn)裝置及方法

參照文獻(xiàn)［14］的方法進(jìn)行電刺激實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 外加電場對菲降解菌生長及代謝的影響

脫氫酶是細(xì)胞胞內(nèi)呼吸鏈上一組重要酶系的統(tǒng)稱，其活性高低表明了細(xì)胞從葡萄糖底物上獲取質(zhì)子和電子以供應(yīng)細(xì)胞代謝活動的能力，也常用于表征微生物細(xì)胞的總體代謝活力，而且能直接表示生物細(xì)胞對其基質(zhì)降解能力的強(qiáng)弱。為考察直流電和交流電對細(xì)菌E.dissolvens生長及活性的電解刺激效果，在實(shí)驗(yàn)中采用測定細(xì)菌脫氫酶的方法來反映細(xì)菌的活性［15］。為研究外加電場對E.dissolvens在生長和底物代謝兩方面的影響，在10 mA電流條件下采用鉑電極分別對預(yù)培養(yǎng)菌液進(jìn)行了直流電和交流電刺激，同時(shí)監(jiān)測實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞脫氫酶活(DHA)、菲和吐溫80的降解速率以及生長曲線三方面的變化，結(jié)果如圖1和圖2所示。

由圖1可知:隨著加電時(shí)間的延長，細(xì)菌脫氫酶活性逐漸增強(qiáng)，菌液中細(xì)胞的生長濃度也逐漸增加。與參比值相比，可以明顯看出加電后細(xì)菌的生長和脫氫酶活得到顯著提升。由圖2可知:加電后吐溫80和菲的濃度也有著顯著的變化。與參比值相比，2種C源的消耗均有所加快，尤其是在直流電條件下，吐溫80的降解速率較參比增長了1倍，在降解后的8 h，DC刺激下的殘余菲的量為2.25，而對照組的殘余菲的量為2.68。很明顯在DC刺激下菲的降解速率是對照組的1.6倍。根據(jù)在無菌培養(yǎng)基中進(jìn)行電解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用相同條件下的10 mA電流不會導(dǎo)致培養(yǎng)基中菲發(fā)生明顯的電化學(xué)降解(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，綜合考慮細(xì)胞菌濃和脫氫酶活同時(shí)增長的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，加電菌液中菲的生物降解速率得到加快。此結(jié)果與筆者在以葡萄糖為唯一底物的培養(yǎng)基體系中的電解實(shí)驗(yàn)相似。這表明電解刺激方法的確可以強(qiáng)化細(xì)胞對底物的代謝，而在“表面活性劑-多環(huán)芳烴”的生物修復(fù)體系中具有應(yīng)用潛力。

圖1 外加電場對菲降解菌生長及脫氫酶活性的影響Fig.1 Effects of external electric field on dehydrogenase activity and cell growth of E.dissolvens

圖2 外加電場對菲降解菌及吐溫80的影響ig.2 Effects of external electric field on the phenanthrene and Tween 80 in E.dissolvens broth

2.2 外加電場對培養(yǎng)液理化性質(zhì)的影響

為了考察加電電場(ORV)對細(xì)胞菌液理化性質(zhì)的影響，因此測定了細(xì)菌溶液的氧化還原電位(ORP)值和pH，結(jié)果見圖3。

圖3 外加電場對細(xì)胞溶液的氧化還原電位和pH的影響Fig.3 Effects of the external electric field on ORP and pH in the E.dissolvens culture broth

由圖3可知:菌液的理化性質(zhì)隨著外加電場的施加，溶液的氧化還原電位急劇下降，尤其是直流電在加電的1 h就達(dá)到－580 mV，交流電刺激后為－230 mV，而參比值僅為100 mV，并在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)顯著低于參照菌液。由圖3可以看出:溶液的pH隨著細(xì)胞的生長代謝逐漸下降，原因可能是在細(xì)胞生長的后期菌液出現(xiàn)一定程度的酸化現(xiàn)象。而加電后溶液的pH略低于參比值，并且在整個(gè)加電過程中pH的變化很小。這一結(jié)果與佘鵬等［14］、許曉路等［15］對以葡萄糖為唯一 C 源的培養(yǎng)物體系的電解刺激作用結(jié)果相似，加電后細(xì)胞的脫氫酶活、底物降解及細(xì)胞的生長顯著提高。在菌液物化性質(zhì)上，加電后菌液的氧化還原電位明顯下降。這極有可能是陰極水電解反應(yīng)所生產(chǎn)的H2導(dǎo)致了溶液氧化還原電位的急劇下降［16］。這正是菌液中長期保持有氧狀態(tài)的強(qiáng)還原性環(huán)境的原因，從而促進(jìn)了菲降解菌的生長和代謝。

3 結(jié)論

研究表明，外加電場對菲的降解有明顯的促進(jìn)作用。低電流刺激下，施加直流電能促進(jìn)菲降解細(xì)菌的生長和代謝，對菲的降解效果明顯。交流電的刺激效果沒有直流電的刺激效果明顯，可能是直流電和交流電電極反應(yīng)產(chǎn)物的不同所造成的。因此，用微生物電解刺激降解多環(huán)芳烴污染是一種綠色可行的環(huán)保方法。電刺激技術(shù)是一個(gè)很復(fù)雜的體系，但是這一結(jié)果有助于加深對微生物電解刺激技術(shù)的認(rèn)識，為以后的應(yīng)用提供廣闊的前景。

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