朱 婧 謝 定 文 李 盛 敏 焦 玲 方 芳

ZHU Jing XIE Ding WEN Li SHENG Min JIAO LingFANG Fang

（長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114）

（College of Chemical and Biology，Changsha University of Science and Technology，Changsha，Hunan 410114，China）

脂肪酶是重要的工業(yè)酶制劑品種之一，可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應，廣泛應用于食品、化工、造紙等工業(yè)生產，目前主要產自微生物，中國長期依賴于進口，價格奇高［1］。稻谷糊粉層中含有大量的脂肪酶，在稻谷碾米時，由于細胞壁被破壞，脂肪酶與稻谷中的油脂接觸而迅速發(fā)生反應導致米糠酸敗，因而稻米脂肪酶在糧食加工廠一直被當作有害物質，一般都要進行鈍化或滅酶活處理后再進行油脂提取和其它深加工［2］。20世紀末，有學者［3］發(fā)現(xiàn)稻米脂肪酶具有對中短鏈脂肪酯解及手性反應催化活力高等特性，開始進行稻米脂肪酶的變廢為寶的研究，采取的方法是將米糠脫脂后提取分離得到脂肪酶后再研究利用。

近些年，酵母菌的應用研究［4，5］越來越廣，而利用酵母菌展示技術更使得脂肪酶的開發(fā)利用達到一個新的階段。酵母菌表面展示脂肪酶具有提高脂肪酶的產量，在使用過程中不用分離純化等優(yōu)點，但并不是所有脂肪酶均能展示成功且具酶活性［6，7］。畢赤酵母（Pichaia pastoris）是一種新型的真核表達系統(tǒng)，可以高效表達外源蛋白而細胞內蛋白分泌極少，可以進行高密度發(fā)酵，糖基化程度較低，同時具備了原核生物生長速度快的優(yōu)點，以及真核細胞蛋白翻譯后的加工修飾功能，適用于大量表達有生物活性的外源蛋白［7，8］，但目前尚未見酵母成功展示稻米脂肪酶及其應用的報道。本研究擬以畢赤酵母GS115作為表達宿主，異源表達稻米脂肪酶基因并初步研究了其酶學性質。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與設備

紫外—可見分光光度計：UV2600型，上海舜宇恒平有限公司；

瓊脂糖凝膠電泳儀：DYCP－31DN型，北京天馳儀誠生物科技有限公司；

凝膠成像儀：DOC 2000型，美國Bio－Red公司；

恒溫搖床：NS－2102C型，天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.1.2 菌株和質粒

pPIC9K：美國Invitrogen公司；

畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115宿主菌：中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 工具酶、試劑與試劑盒

限制性內切酶 EcoR I、Not I、Mlu I、Sac I，T4 DNA連接酶，DNA Marker等：大連寶生物科技有限公司（takara）；

質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒：德國Qiagen公司；

對硝基苯酚丁酸酯（p NPB）、PEG3350、LiCl：美國Sigma公司；

YPD培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基、YNB培養(yǎng)基：北京索萊寶生物科技有限公司；

其他為進口分裝或國產分析純。

1.1.4 GCW14－RL基因 根據張軒薇等［8］的 GCW14序列以及Chuang等［9］的Rlipase序列，設計了 GCW14－RL融合基因序列，GCW14－RL基因的5’端添加了Eco RI限制性內切酶位點，3’端添加了Not I位點，GCW14和RL之間是Mlu I位點。Eco RI－GCW14－Mlu I－RL－Not I基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆到p UC57載體的多克隆位點上，命名為p UC57－GCW14－RL。

1.2 方法

1.2.1 pPIC9K－GCW14－RL載體的構建 分別將p UC57－GCW14－RL和p PIC9K載體進行Eco RI和 Not I雙酶切反應，37℃水浴4 h之后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。采用膠回收試劑盒回收目的基因片斷GCW14－RL和pPIC9K載體片段。之后用T4 DNA Ligase進行連接反應，22℃過夜連接，之后轉化到DH5a感受態(tài)細胞中，涂布在含有amp和kana抗性的LB固體培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)。挑取克隆進行搖菌，質粒抽提，并進行Eco RI和Not I雙酶切反應，之后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定［10］。將陽性克隆命名為pPIC9K－GCW14－RL。

1.2.2 pPIC9K－GCW14－RL轉化到畢氏酵母GS115中

（1）煮沸1 m L鮭魚精DNA 5 min，迅速冰浴以制備單鏈擔體DNA；

（2）將pPIC9K－GCW14－Rl用Sac I內切酶進行線性化處理；

（3）將感受態(tài)酵母菌離心，以Tips去除殘余的LiCl溶液；

（4）對于每一個轉化，按以下順序加入：50%PEG3350，240μL；1 M LiCl，36μL；2 mg／m L 單 鏈 Salmon sperm DNA，25μL；5～10μg／50μL H2O 質粒DNA，50μL。

（5）劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體完全分布均勻（約1 min）；

（6）30℃水浴孵育30 min；

（7）42℃水浴熱休克20～25 min；

（8）6 000～8 000 r／min離心收集酵母菌體；

（9）重懸酵母于1 m L YPD培養(yǎng)基，30℃搖床孵育；

（10）1～4 h后，取25～100μL菌液鋪YD選擇性培養(yǎng)基平板（1.67%YNB＋2%dextrose＋1%瓊脂粉），于30℃培養(yǎng)2～3 d鑒定（將表達菌株和對照菌株在固體培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)至轉化子出現(xiàn)）。因為GS115是組氨酸缺陷型菌，YD培養(yǎng)基里面沒有組氨酸，因此GS115在YD培養(yǎng)基上不能生長，而pPIC9K帶組氨酸合成酶基因，只有成功轉化了pPIC9k－GCW14－RL的GS115菌才能在YD培養(yǎng)基上生長。

1.2.3 粗酶液制備 將畢赤酵母重組菌接種至YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，250 r／min培養(yǎng)24 h，按1%的接種量轉接到新鮮的BMGY培養(yǎng)基中，30℃，250 r／min培養(yǎng)5 d，每隔24 h加甲醇誘導，收集發(fā)酵菌體，用p H 8.0緩沖液洗滌3次，用少量緩沖液重懸，即得重組脂肪酶粗酶液。

1.2.4 脂肪酶活力測定 采用對硝基苯酚法測定脂肪酶的活力［8－11］，酶活力測定反應體系總體積為10 m L，包括1 m L p NPB底物溶液（50 m M）以及9 m L 50 m M Tris—HCl（p H 8.0）；反 應 體 系 混 勻 后 在 加 熱 振 蕩 器 中 35 ℃，800 r／min預熱5 min后，加入底物進行反應，10 min后立即12 000 r／min離心終止反應；反應結束后取上清液在405 nm處測定吸光度，只加底物跟緩沖液的樣品為空白，設3個平行，記錄A405值。一個酶活力單位為每分鐘水解所加底物生成1μmol p NP所需的酶量。

1.2.5 最適溫度 以p H 8.0的Tris—HCl緩沖液重懸菌體，在30，35，40，45，50，55，60，65，70℃分別保溫10 min后，以p NPB為底物，測定重組畢赤酵母在35℃下的水解活性。

1.2.6 熱穩(wěn)定性 以p H 8.0的Tris—HCl緩沖液重懸菌體，在50 ℃下保溫0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h后，以p NPB為底物，測定重組畢赤酵母在35℃下的水解活性。

1.2.7 最適p H 分別以p H 6.0，6.5，7.0的磷酸緩沖液，p H 7.5，8.0，8.5的 Tris—HCl緩沖液，p H 9.0，9.5，10.0的甘氨酸緩沖液洗滌菌體3次，并重懸，20℃保溫24 h，再用p H 8.0的Tris—HCl緩沖液洗滌3次，p NPB為底物，測定重組畢赤酵母在35℃下的水解活性。

1.2.8 固定化效果 將使用過后的酵母菌體用緩沖液洗滌3次并重懸，重復1.2.4的步驟測重組酵母菌的脂肪酶活力。

2 結果與分析

2.1 pPIC9k－GCW14－RL載體的構建結果

p UC57－GCW14－RL的 雙 酶 切 結 果 見 圖1（a）?；?收GCW14－RL與pPIC9k載體連接后的質粒pPIC9k－GCW14－RL雙酶切鑒定結果見圖1（b），得到了預期大小的兩個片段。說明成功將GCW14－RL亞克隆到了pPIC9k載體。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳結果Figure 1 Agarose gel electrophoresis

2.2 pPIC9k－GCW14－RL載體轉化 GS115的結果

將pPIC9k－GCW14－RL質粒轉化到GS115感受態(tài)的結果見圖2。由于GS115是組氨酸缺陷型菌，因此在YD培養(yǎng)基上不能生長，只有成功轉化了pPIC9K的GS115菌才能在YD培養(yǎng)基上生長。

圖2 GS115在YD培養(yǎng)基上的生長情況Figure 2 Grouth of GS115 in YD medium

2.3 酵母表面展示稻米脂肪酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性

測定不同溫度下該重組脂肪酶的酶活，由圖3可知，該重組脂肪酶最適作用溫度為35℃，溫度30～45℃范圍內都能保持80%以上的相對酶活力。比RL游離酶的最適溫度［10］低15℃。但該重組脂肪酶在50℃保溫1 h仍能保持97.3%的相對酶活性，在50℃保溫3 h后仍能保持80%以上相對的酶活力，證明該酶在50℃較高溫度下仍有較好的溫度穩(wěn)定性（圖4）。

圖3 酵母表面展示稻米脂肪酶的最適溫度Figure 3 Optimum of temperature on the activity of surface displayed RL

圖4 酵母表面展示稻米脂肪酶的熱穩(wěn)定性Figure 4 Thermal stablity of the activity of surface displayed RL

2.4 酵母表面展示稻米脂肪酶的最適p H

測定不同p H緩沖液條件下的酶活繪制曲線見圖5。該重組脂肪酶最適p H 為8.0，在p H 7.0到p H 10.0范圍內都能保持80%以上的酶活力。與RL游離酶的最適p H［8］基本一致。但p H低于7.0時，酶活下降較快，p H為6.0時，酶活只有最高酶活的52%。

圖5 酵母表面展示稻米脂肪酶的最適p HFigure 5 Effect of p H on the activity of surface displayed RL

2.5 酵母表面展示脂肪酶的固定化效果

酶的操作穩(wěn)定性是固定化酶的重要特性之一，酵母展示稻米脂肪酶省去了酶的固定化操作卻具有可重復使用的固定化酶的特性。圖6顯示了酵母展示稻米脂肪酶的固定化效果，該重組脂肪酶在初次使用后，酶活性基本沒損失，重復使用5次之后仍具有80%以上的相對酶活力，活性降低的原因可能是因為每次重復回收有少量的酵母展示脂肪酶的損失以及回收過程中多次沖洗導致活性降低以及反應過程中酶部分熱失活所致。

圖6 酵母表面展示稻米脂肪酶的使用次數(shù)與相對活性Figure 6 Activity of surface displayed RL after repeated use times

3 結論

稻米脂肪酶對油脂具有很好的酯解活性，過去由于其難于分離提純而被廢棄。本試驗將來自稻米脂肪酶（RL）的基因轉化到畢赤酵母GS115宿主菌中，通過搖瓶發(fā)酵，測定其最適作用溫度為35～45℃，最適p H為8.0，與游離RL相差不大，而且酵母菌通過高密度發(fā)酵可獲得大量具有RL活性的菌體，不需要特別的分離提純和固定化處理，其重復使用5次依然可以保持80%以上的活性，這就為拓廣稻米脂肪酶的利用提供了依據。

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