司君增，魏麗萍，郭秀玲，宋方禹，亓勤德

（萊蕪市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 萊蕪 271199）

·論著·

葡萄糖腦苷脂酶基因多態(tài)性與帕金森病的相關(guān)性研究

司君增，魏麗萍，郭秀玲，宋方禹，亓勤德

（萊蕪市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 萊蕪 271199）

目的研究中國(guó)山東人群帕金森病患者的葡萄糖腦苷脂酶(Glucocerebrosidase，GBA)基因N370S、V394L和L444P突變位點(diǎn)多態(tài)性，探討GBA基因突變與帕金森病的相關(guān)性。方法應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接DNA測(cè)序法對(duì)60例帕金森病患者及60例正常對(duì)照組的9、10號(hào)外顯子進(jìn)行檢測(cè)，然后進(jìn)行測(cè)序?qū)Ρ确治?。結(jié)果測(cè)序結(jié)果顯示帕金森病患者和正常對(duì)照組的GBA基因外顯子9和外顯子10核苷酸序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)突變點(diǎn)。結(jié)論該研究不支持GBA基因N370S、V394L和L444P突變位點(diǎn)是中國(guó)山東人群帕金森病的危險(xiǎn)因素。

帕金森病；葡萄糖腦苷脂酶基因；基因突變

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種中老年人常見的運(yùn)動(dòng)障礙疾病。由于該病具有較強(qiáng)的致殘性，嚴(yán)重影響了患者的正常工作及生活，給患者家屬及社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，已成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)之一[1]。研究易感候選基因是探索PD這種復(fù)雜疾病的關(guān)鍵步驟。近年來，GBA基因成為研究的熱點(diǎn)，而且，不同種族不同區(qū)域人群有遺傳異質(zhì)性，之前的研究結(jié)果不一[2-3]。重要的是，中國(guó)人群PD患者基數(shù)龐大，中國(guó)大陸山東人群尚未有類似報(bào)道，說明開展對(duì)山東人群的GBA基因與PD相關(guān)性的深入研究，具有重要的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料病例組系2011年9月至2013年7月山東省萊蕪市人民醫(yī)院、山東大學(xué)齊魯醫(yī)院、山東省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及住院的帕金森病患者，帕金森病的診斷參照英國(guó)腦庫(kù)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組系萊蕪市人民醫(yī)院門診健康體檢人員，排查錐體外系及其他神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。病例組及對(duì)照組各60例，均為山東地區(qū)漢族，性別及年齡分布兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 提取基因組DNA抽取研究對(duì)象外周靜脈血5 ml，用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝。常規(guī)酚/氯仿法提取基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)(PCR)引物合成真、假基因具有高度同源性，首先將真假基因區(qū)分開，在此基礎(chǔ)上分別擴(kuò)增單個(gè)外顯子；參照相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物[2]，由上海生工公司合成。引物序列見表1(均為5'-3'方向)。

表1 GBA基因PCR引物序列

1.2.3 PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5 min，94℃變性5 min，退火45 s(外顯子8～11、外顯子9、外顯子10的退火溫度分別為40℃、50℃、50℃)，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)體系總體積25 μl，包括ddH2O、10×PCR buffer、5 mmol/L的4種dNTP、5 mmol/L的MgCl2、10 μmol/L引物A(正向)、10 μmol/L引物A(反向)、模板DNA、TaqDNA聚合酶(5 U/μl)。

1.2.4 序列測(cè)定從瓊脂糖凝膠中回收擴(kuò)增外顯子9、外顯子10的PCR產(chǎn)物，純化產(chǎn)物測(cè)序委托上海生工公司和北京天根公司完成，測(cè)序結(jié)果與Gene-Bank提供的序列用Blast軟件進(jìn)行比對(duì)；根據(jù)比對(duì)結(jié)果判別基因有無突變。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，GBA基因第8～11外顯子擴(kuò)增成功(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度1 682 bp，見圖1)，將其產(chǎn)物純化后作為模板擴(kuò)增GBA基因外顯子9(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度362 bp，見圖2)和外顯子10(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度329 bp，見圖3)也擴(kuò)增成功，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示為相應(yīng)特異長(zhǎng)度的單一條帶，部分電泳圖如下：

圖1 8～11號(hào)外顯子條帶（1 682 bp）

圖2 9號(hào)外顯子條帶（362 bp）

圖3 10號(hào)外顯子條帶（329 bp）

2.2 DNA直接測(cè)序結(jié)果測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)后PD病例組和對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)GBA基因9號(hào)外顯子N370S(見圖4)突變和V394L(見圖5)突變，也未發(fā)現(xiàn)10號(hào)外顯子L444P(見圖6)突變。部分測(cè)序峰圖如下：

圖4 N370S突變：圖中68位A→G

圖5 V394L突變：圖中139位G→T

圖6 L444P突變：圖中118位T→C

3 討論

葡萄糖腦苷脂酶(GBA)基因定位于人染色體1q21。基因全長(zhǎng)為7.6 kb，含11個(gè)外顯子；假基因位于下游16 kb。在同源區(qū)內(nèi)，96%的核苷酸是一致的[4]。因此研究GBA基因，尤其在研究GBA基因的多態(tài)性時(shí)，前提必須將真、假基因區(qū)分開，否則課題研究將導(dǎo)致一系列的誤差，本文根據(jù)真假基因序列的差異而設(shè)計(jì)的特異引物首先擴(kuò)增真基因的外顯子8～11，此引物與假基因不能結(jié)合從而不能擴(kuò)增假基因，從而將此片段的真假基因區(qū)分開，然后根據(jù)每個(gè)外顯子設(shè)計(jì)相應(yīng)引物擴(kuò)增單個(gè)外顯子[2]。

GBA基因編碼由536個(gè)氨基酸組成的葡萄糖腦苷脂酶，該酶將葡萄糖腦苷脂水解為神經(jīng)酰胺被機(jī)體再利用。GBA基因突變導(dǎo)致葡萄糖腦苷脂酶活性降低，不能將葡萄糖腦苷脂水解為神經(jīng)酰胺，釋放的葡糖腦苷脂就會(huì)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(脾、肝、骨髓)中的巨噬細(xì)胞吞入并儲(chǔ)存于其溶酶體中形成十分獨(dú)特的微管狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而干擾正常細(xì)胞凋亡[5]。

戈謝病(Gaucher's disease)是一種常染色體隱形遺傳疾病，稱葡萄糖神經(jīng)酰胺貯積病，一般認(rèn)為其病因源于葡萄糖腦苷脂酶(GBA)基因突變導(dǎo)致該酶活性降低，造成葡萄糖腦苷脂酶在網(wǎng)狀內(nèi)皮組織巨噬細(xì)胞中的大量沉積，出現(xiàn)了特征表現(xiàn)的戈謝細(xì)胞。目前已經(jīng)報(bào)道的GBA基因突變有200多種，其中常見的有N370S、84GG、L444P，V394L，研究發(fā)現(xiàn)在猶太民族戈謝患者中N370S突變占到78%，而在非猶太民族戈謝病患者中最常見的突變則是L444P(36%)，其次是N370S(23%)[6-7]，因此本研究選取了以上突變頻率最高的三個(gè)位點(diǎn)N370S、V394L和L444P進(jìn)行研究。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)60例帕金森病患者和60例正常對(duì)照的GBA基因的外顯子9、10的核苷酸序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)基因突變，這與焦玲等[8]對(duì)中國(guó)貴州人群的研究報(bào)道結(jié)果相一致。該研究也未發(fā)現(xiàn)V394L和L444P突變，但在挪威、巴西、以色列、意大利、臺(tái)灣、新加坡華裔人群等PD患者的研究中卻發(fā)現(xiàn)了這兩個(gè)位點(diǎn)的突變[9-15]。這種差異可能是因?yàn)槲覀兊难芯繕颖玖肯鄬?duì)較小，或者是地區(qū)、種族差異引起。

國(guó)外學(xué)者研究以色列德系猶太人帕金森病患者的GBA基因突變，N370S是最常見突變位點(diǎn)；挪威學(xué)者對(duì)311例PD患者GBA基因進(jìn)行篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7例有基因突變的患者中有4例為N370S突變；然而臺(tái)灣及新加坡華裔人群PD患者的GBA基因測(cè)序分析未發(fā)現(xiàn)N370S突變[12]。因此，我們推測(cè)N370S位點(diǎn)不是亞洲人群的突變熱點(diǎn)，而是歐洲、美洲等發(fā)達(dá)國(guó)家PD患者GBA基因的突變熱點(diǎn)，同時(shí)也表明GBA基因N370S多態(tài)性可能因人群種族和地區(qū)不同而存在差異性。

盡管本研究我們未發(fā)現(xiàn)PD患者及正常對(duì)照組的葡萄糖腦苷脂酶基因突變，但不能就此排除在帕金森病的發(fā)病機(jī)制中，GBA基因突變參與發(fā)病的可能性，在以后的研究中，我們將增大PD患者樣本量及基因位點(diǎn)的監(jiān)測(cè)，為進(jìn)一步闡明PD的發(fā)病機(jī)制提供寶貴的基礎(chǔ)資料。

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Association between glucocerebrosidase genetic polymorphisms and Parkinson's disease.

SI Jun-zeng,WEI Li-Ping,GUO Xiu-ling,SONG Fang-yu,QI Qin-de.Department of Neurology,Laiwu People's Hospital,Laiwu 271199, Shandong,CHINA

ObjectiveTo study the polymorphisms of Glucocerebrosidase(GBA)gene mutation sites (N370S,V394L and L444P)in patients with Parkinson's disease in Shandong province of China,and to explore the relationship between GBA gene and Parkinson's disease(PD).MethodsExon 9 and exon 10 of GBA gene were amplified the in 60 PD patients and 60 normal controls by polymerase chain reaction(PCR).PCR products were analyzed by direct DNA sequencing.BLAST was used for sequences analysis.ResultsThe sequence results demonstrated that the nucleotide sequences of exon 9 and exon 10 of GBA gene in the patients of Parkinson's disease and normal controls were the same,with no mutation found.ConclusionThe GBA gene mutation sites(N370S,V394L and L444P)may not be risk factors for PD in Chinese Shandong population.

Parkinson's disease;Glucocerebrosidase gene;Gene mutation

R742.5

A

1003—6350（2014）07—0944—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.07.0367

2013-10-25)

萊蕪市人民醫(yī)院科研立項(xiàng)課題（編號(hào)：yylx2013022）

司君增。E-mail：sjz2835@163.com