葉家宏 ,段園園,申衛(wèi)紅 ,黃月純
(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510405; 2.貴州省腫瘤醫(yī)院,貴州 貴陽 550003;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405)
三黃桃葛膠囊由黃芪、葛根、制大黃和地黃等中藥組方,具有清熱生津、益氣滋陰和活血化瘀的作用,適用于治療2型糖尿病氣陰兩虛夾瘀型患者。黃芪中黃酮類成分[1-2],葛根中葛根素[3-4],地黃中梓醇及寡糖[5-6]、大黃蒽醌[7-8]等成分,都具有不同程度的調(diào)節(jié)血糖,抑制胰島素抵抗和糖尿病狀態(tài)下異常的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的表達活性,增強胰島素敏感性,抑制腎上腺素和四氧嘧啶所致的小鼠的血糖升高,改善糖耐量,減少胰島素抵抗等作用。本研究中采用高效液相色譜(HPLC)法分別對三黃桃葛膠囊中葛根、制大黃及黃芪的主要成分進行含量測定,為其質(zhì)量控制提供參考。
HP 1100型高效液相色譜儀(Agilent公司);二極管陣列檢測器(Agilent公司);BP 211D 型電子天平(d=0.01 mg,德國賽多利斯公司);SK7200LHC型超聲波清洗儀(上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司);TG16-WS型臺式高速離心機(湖南賽特湘儀離心機有限公司)。葛根素對照品(批號為110552-200741),毛蕊異黃酮苷對照品(批號為 110907),大黃素對照品(批號為0756-9908),蘆薈大黃素對照品(批號為110795-200806),大黃素甲醚對照品(批號為 110758-200610),大黃酸對照品(批號為 110757-2008206),大黃酚對照品(批號為0756-9908),均購自中國藥品生物制品檢定所;三黃桃葛膠囊(批號分別為20120321,20120322,20120323,自制);甲醇為色譜純(德國Merck公司),水為純凈水,其他試劑均為分析純。
2.1.1 色譜條件[9]
色譜柱:Zorbax SB C18柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-水,梯度洗脫,0~5 min甲醇為20%→25%,5~10 min甲醇為25%→30%,10~18 min甲醇為30%→30%,18~22 min甲醇為 30%→20%;檢測波長:250 nm;流速:1 mL/min;柱溫:室溫。
2.1.2 溶液制備
取葛根素對照品適量,精密稱定,加60%甲醇制成每1 mL含 77.2 μg的溶液,即得對照品溶液。取本品內(nèi)容物約 0.1 g,精密稱定,精密加入60%甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理30 min,取出,用60%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,即得供試品溶液。另取缺葛根素的陰性對照品適量,同法制成陰性對照品溶液。
2.1.3 方法學(xué)考察
專屬性試驗:精密吸取2.1.2項下 3種溶液各5 μL,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,結(jié)果陰性無干擾,見圖1。
線性關(guān)系考察:精密吸取葛根素對照品溶液 1,2,5,10,15,20 μL,注入高效液相色譜儀,按擬訂色譜條件進行測定,以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、進樣量(X,μg)為橫坐標(biāo)進行線性回歸,得葛根素回歸方 程 Y=4 322.90 X-4.57,線 性 范 圍 為 0.077 ~1.54 μg(r=0.999 9)。
精密度試驗:精密吸取同一對照品溶液各5 μL,重復(fù)進樣6次,測定葛根素峰面積。結(jié)果的 RSD為 0.13%,表明儀器精密度良好。
穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液 5 μL,分別于 0,2,4,8,12,24 h時進樣,測定峰面積。結(jié)果的 RSD為 0.24%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
重復(fù)性試驗:取本品(批號20120321)內(nèi)容物,依法平行制備6份供試品溶液,各進樣5μL。結(jié)果平均含量為 15.71 mg/g,RSD為0.23%,表明方法重復(fù)性良好。
加樣回收試驗:取已知含量的本品(批號為 20120321)內(nèi)容物 6 份,每份約 0.05 g,精密稱定,分別精密加入葛根素對照品溶液,依法制備供試品溶液并進樣分析。結(jié)果見表1。
圖1 葛根素高效液相色譜圖
表1 葛根素加樣回收試驗結(jié)果(n=6)
2.1.4 樣品含量測定
精密吸取對照品溶液、供試品溶液各5 μL,注入高效液相色譜儀,測定峰面積,按外標(biāo)法計算含量,結(jié)果見表2。
表2 7種成分含量測定結(jié)果(mg/g)
2.2.1 色譜條件[9-10]
色譜柱:Zorbax Eclipse XDB C18柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇 -0.1%磷酸,梯度洗脫:0~13 min甲醇為82%→82%,13~24 min甲醇為82%→90%,24~30 min甲醇為90%→82% ;檢測波長:254 nm;流速:1 mL /min;柱溫:室溫。
2.2.2 溶液制備
精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量,加甲醇分別制成每 1 mL含蘆薈大黃素 16.4 μg、大黃 酸 20.5 μg、大 黃 素 18.1 μg、大 黃 酚 17.4 μg,大 黃 素 甲 醚23.4 μg的混合溶液,作為對照品溶液。取本品內(nèi)容物約 0.5 g,精密稱定,精密加入甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理30 min,取出,用甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液25 mL,置燒瓶中,揮去溶劑,加8%鹽酸溶液10 mL,超聲處理2 min,再加三氯甲烷10 mL,回流1 h,放冷,置分液漏斗中,用少量三氯甲烷洗滌容器,并入分液漏斗中,分取三氯甲烷層,酸液用三氯甲烷提取3次,每次10 mL,合并三氯甲烷液,減壓回收溶劑至干,殘渣加甲醇使溶解,加甲醇定容至5 mL,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。另取缺大黃陰性對照品適量,同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。
2.2.3 方法學(xué)考察
專屬性試驗:精密吸取2.2.2 項下 3 種溶液各 10 μL,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)果陰性無干擾,見圖2。
線性關(guān)系考察:精密吸取蒽醌混合對照品溶液 1,2,5,10,20,30 μL,注入高效液相色譜儀,按擬訂色譜條件測定。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、進樣量(X,μg)為橫坐標(biāo)進行線性回歸。蘆薈大黃素回歸方程 為 Y=4 483.28 X-0.29,線 性 范 圍 為 0.016 ~0.49 μg(r= 0.999 9);大黃酸回歸方程 為 Y= 3 196.38 X-0.95,線 性 范 圍 為 0.020 ~ 0.61 μg(r= 0.999 9);大黃素回歸方程 為 Y= 3 288.48 X-1.35,線 性 范 圍 為 0.018 ~ 0.54 μg(r= 0.999 9);大黃酚回歸方程 為 Y=4 351.54 X-3.10,線 性 范 圍 為 0.017 ~0.52 μg(r=0.999 9);大黃素甲醚回歸方程為 Y= 2 056.37 X-2.47,線性范圍為 0.023 ~ 0.70 μg(r= 0.999 9)。
精密度試驗:精密吸取同一對照品溶液各10 μL,重復(fù)進樣6次,測定峰面積。結(jié)果大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酸平均峰面積的 RSD分別為 0.29%,1.21%,0.68%,0.93% ,0.38% ,表明儀器精密度良好。
穩(wěn)定性試驗:精密吸取同一供試品溶液10 μL,分別于0,2,4,8,12,24 h時進樣,測定峰面積。結(jié)果表明,大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酸平均峰面積的 RSD分別為0.15% ,0.91% ,0.45% ,0.76% ,0.33% ,表明 5 種游離蒽醌在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。
重復(fù)性試驗:取本品(批號為20120321)內(nèi)容物,依法平行制備6份供試品溶液,各進樣10 μL。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為 0.108,0.376,0.104,0.279,0.071 mg/g,RSD 均小于 1.55%,表明方法重復(fù)性良好。
加樣回收試驗:取已知含量的本品(批號為20120321)內(nèi)容物 6份,每份約 0.25 g,精密稱定,分別精密加入一定量的蒽醌混合對照品溶液,依法制備供試品溶液并進樣分析。結(jié)果見表3。
2.2.4 樣品含量測定
精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL,注入高效液相色譜儀,測定峰面積,按外標(biāo)法計算含量。結(jié)果見表2。
圖2 5種游離蒽醌高效液相色譜圖
2.3.1 色譜條件[10]
色譜柱:Zorbax SB-C18柱 (250 mm ×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-0.5%甲酸溶液,梯度洗脫,0~15 min甲醇為25%→25%,15~30 min甲醇為25%→40%,30~35 min甲醇為40%→70%,35~45 min甲醇為70%→70%,45~55 min甲醇為70%→25% ;檢測波長:260 nm;流速:1 mL /min;柱溫:室溫。
2.3.2 溶液制備
取毛蕊異黃酮苷對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含 57.2 μg 的溶液,即得對照品溶液。取本品內(nèi)容物約 0.8 g,精密稱定,精密加入60%甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理30 min,取出,用60%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,即得供試品溶液。另取缺黃芪陰性對照品適量,按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。
2.3.3 方法學(xué)考察
專屬性試驗:精密吸取2.3.2項下3種溶液各 5 μL,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)果陰性無干擾,見圖3。
線性關(guān)系考察:精密吸取毛蕊異黃酮苷對照品溶液1,2,5,10,15,20,30 μL,注入高效液相色譜儀,按擬訂色譜條件進行測定,以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、進樣量(X,μg)為橫坐標(biāo)進行線性回歸,得毛蕊異 黃酮苷 的 回歸方程 Y=3 755.04 X-3.92,線性范 圍 為0.057 ~ 1.72 μg(r= 0.999 9)。
精密度試驗:精密吸取同一對照品溶液各5 μL,重復(fù)進樣6次,測定毛蕊異黃酮苷峰面積。結(jié)果的 RSD為0.23%,表明儀器精密度良好。
穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液 5 μL,分別于 0,2,4,8,12,24 h時進樣,測定峰面積。結(jié)果的 RSD為 0.34%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。
重復(fù)性試驗:取本品(批號為 20120321)內(nèi)容物,依法平行制備6份供試品溶液,各進樣 5 μL。結(jié)果平均含量為0.316 mg /g, RSD 為 0.26% ,表明方法重復(fù)性良好。
加樣回收試驗:取已知含量的本品(批號為20120321)內(nèi)容物 6份,每份約 0.4 g,精密稱定,分別精密加入一定量的毛蕊異黃酮苷對照品溶液,依法制備供試品溶液并進樣分析。結(jié)果見表4。
表3 5個游離蒽醌加樣回收試驗結(jié)果(n=6)
圖3 毛蕊異黃酮苷高效液相色譜圖
表4 毛蕊異黃酮苷加樣回收試驗結(jié)果(n=6)
2.3.4 樣品含量測定
精密吸取對照品溶液、供試品溶液各5 μL,注入高效液相色譜儀,測定峰面積,按外標(biāo)法計算含量。結(jié)果見表2。
葛根素含量測定色譜條件采用2010年版《中國藥典(一部)》葛根項下方法[9],結(jié)果葛根素色譜峰分離效果不佳,通過調(diào)整流動相比例,獲得較好的分離效果。大黃游離蒽醌含量測定方法參考2010年版《中國藥典(一部)》大黃項下方法[9],參考文獻[10]對流動相比例進行了優(yōu)化。由于制劑中毛蕊異黃酮苷含量較低,色譜條件對毛蕊異黃酮苷色譜峰的分離效果影響較大。通過對不同色譜柱 Zorbax SB-C18,Nucleodμr C18Gravity,Kromasil 100-5 C18以及不同流動相系統(tǒng)乙腈-0.2%甲酸、甲醇-0.2%甲酸、甲醇 -0.5%甲酸的不同梯度進行篩選,確定了色譜柱為 Zorbax SB-C18柱,流動相為甲醇-0.5%甲酸梯度洗脫系統(tǒng)。
葛根素、大黃5種游離蒽醌、毛蕊異黃酮苷的供試品溶液制備參考《中國藥典》中方法,經(jīng)試驗采用60%甲醇為溶劑提取葛根素、毛蕊異黃酮苷,甲醇為溶劑提取蒽醌效果較好,采用了超聲處理20,30,40 min,結(jié)果超聲處理30 min即提取完全。
本研究中建立的7種成分含量測定方法經(jīng)方法學(xué)考察,方法準(zhǔn)確、簡便、專屬性強,為三黃桃葛膠囊質(zhì)量控制提供了參考。
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