李培培，王桐生，吳德玲*，張 偉，馬鳳愛，宋 潔，左亞峰，喬金為

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽 合肥 230038)

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正交試驗(yàn)優(yōu)選桃紅四物湯顆粒的醇提工藝研究

李培培1,2，王桐生3，吳德玲1,2*，張 偉1,2，馬鳳愛1,2，宋 潔1,2，左亞峰1,2，喬金為1,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽 合肥 230038)

目的：優(yōu)選桃紅四物湯顆粒的乙醇提取工藝。方法：采用正交試驗(yàn)，以芍藥苷轉(zhuǎn)移率及出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察料液比濃度、提取次數(shù)、提取時(shí)間對(duì)提取工藝的影響。結(jié)果：優(yōu)選出的最佳提取工藝為：加8倍量70%醇，提取3次，每次1h。結(jié)論：該提取工藝設(shè)計(jì)合理，穩(wěn)定可行。

桃紅四物湯；芍藥苷；正交試驗(yàn)；提取工藝

桃紅四物湯出自清代吳謙所著《醫(yī)宗金鑒》[1]，由熟地、白芍、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花六味組成，具有活血祛瘀、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)的功效。近年來有學(xué)者對(duì)其抗炎、改善微循環(huán)、提高免疫力、促進(jìn)骨折愈合、延緩肝臟纖維化進(jìn)程等[2-6]藥效進(jìn)行了研究。由于傳統(tǒng)水煎劑煎煮、攜帶、服用不方便，故將湯劑研制成顆粒劑，既克服湯劑的不足又能保持其綜合療效，但由于水提浸膏具有出膏率大、吸濕性強(qiáng)的特點(diǎn)，因此本研究采用醇提法制備顆粒所需浸膏。本研究以芍藥苷轉(zhuǎn)移率及出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)探索桃紅四物湯的最佳醇提工藝，為進(jìn)一步對(duì)桃紅四物湯的藥理學(xué)作用研究和制備桃紅四物湯的其他劑型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫高效液相色譜僅(high performance liquid chromatography, HPLC)儀：包括G1312C四元梯度泵、G4212B二極管陣列檢測(cè)器、G1316A柱溫箱、Chemstation色譜工作站；十萬分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯CP225D)；超聲清洗儀(天津奧特賽恩斯AS312)；恒溫水浴鍋(江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠HH-S2系列)；真空干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠DZF-6050)。

1.2 試藥

熟地黃(批號(hào)：13120101)，白芍(批號(hào)：13072001)，當(dāng)歸(批號(hào)：14021101)，川芎(批號(hào)：13100702)，桃仁(批號(hào)：13121001)，紅花(批號(hào)：13091001)，購(gòu)自安徽協(xié)和城藥業(yè)有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)金傳山教授鑒定，熟地黃為玄參科植物地黃Rehmanniaglutinosalibosch.的干燥塊根；白芍為毛茛科植物芍藥PaeoniaLacifloraPall.的干燥根；當(dāng)歸尾傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根；川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort的干燥根莖；桃仁為薔薇科植物桃Prunuspersica(L.)Batsch的干燥成熟種子；紅花為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花。芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：110736-201136，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；甲醇(色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)；乙腈(色譜純，美國(guó)天地有限公司)；水(娃哈哈純凈水)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 芍藥苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件： 色譜柱：SHIM-PACK VP-ODS柱(250mm×4.6mm 5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸水溶液(12∶88)；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。在上述試驗(yàn)條件下，芍藥苷色譜峰與供試品溶液中其他色譜峰達(dá)到基線分離，見圖1。

圖1 桃紅四物湯醇提液HPLC圖譜

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 取干燥至恒重的芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為0.15mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密稱取芍藥苷對(duì)照品10.16mg，于10mL容量瓶中，加色譜甲醇定容，搖勻。精密吸取0.3、0.75、1、2、3mL，分別置于10mL容量瓶中，用色譜甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，各進(jìn)樣20μL，按以上色譜條件測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析?；貧w方程為y=1099234.8506x-36467.9552, r=0.999 9，芍藥苷在0.6096～6.0960μg范圍內(nèi)與峰面積成良好線性關(guān)系。

2.1.4 供試品溶液制備 按桃紅四物湯的處方配比(熟地黃、白芍、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花為12∶9∶9∶6∶9∶6)，取一倍量的飲片51g，按正交試驗(yàn)表提取所得醇提液，趁熱過濾，合并濾液，再置于60℃恒溫水浴鍋上濃縮至約450mL，移至500mL容量瓶中，加相應(yīng)濃度的乙醇定容至刻度。精密吸取4mL至蒸發(fā)皿中，揮干溶劑，加色譜甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(0.45μm微孔濾膜)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液20μL，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測(cè)定芍藥苷峰面積，芍藥苷的RSD為1.71%(n=6)，表明該方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12h時(shí)進(jìn)樣20μL，按上述色譜條件測(cè)定芍藥苷的峰面積，RSD為1.08%(n=5)，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.4”項(xiàng)下制備6份供試品溶液，精密吸取20μL，按上述色譜條件測(cè)定供試品溶液中芍藥苷的含量。芍藥苷的平均含量為13.535mg/g，RSD為1.004%(n=6)。表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知芍藥苷含量的供試品溶液6份，分別加入一定量的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定芍藥苷的含量，結(jié)果顯示芍藥苷的平均回收率為100.10%，RSD為1.46%(n=6)。

2.1.9 藥材中芍藥苷含量測(cè)定 按2010版《中華人民共和國(guó)藥典》一部白芍中含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制備白芍供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，測(cè)得白芍中芍藥苷含量為32.27mg/g。

2.1.10 芍藥苷轉(zhuǎn)移率測(cè)定 精密吸取供試品溶液20μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法的線性方程，由供試品峰面積計(jì)算出芍藥苷的含量。芍藥苷轉(zhuǎn)移率=芍藥苷質(zhì)量/白芍藥材中芍藥苷質(zhì)量×100%，計(jì)算芍藥苷的轉(zhuǎn)移率。

2.2 出膏率測(cè)定

取按正交試驗(yàn)表提取所得水提液，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法濃縮提取液并定容至500mL，精密移取50mL置于已經(jīng)干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴上蒸發(fā)，蒸干后將蒸發(fā)皿移至80℃烘箱中干燥5h，取出放置于干燥器中，冷卻30min后，精密稱定，再在上述溫度下干燥1h，冷卻，稱定質(zhì)量。重復(fù)操作直至連續(xù)2次稱得的質(zhì)量差異不超過3mg為止。按下式計(jì)算出膏率：出膏率=干膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%。

2.3 醇提正交試驗(yàn)

2.3.1 因素水平安排 按照桃紅四物湯組方(熟地黃、白芍、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花為12∶9∶9∶6∶9∶6)，按“2.1.4”項(xiàng)下方法提取，以料液比(A)、醇濃度(B)、提取次數(shù)(C)、提取時(shí)間(D)為考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平。以提取液中的芍藥苷轉(zhuǎn)移率和干膏率為考察指標(biāo)，選用L9(34)正交表進(jìn)行表頭設(shè)計(jì)和安排實(shí)施試驗(yàn)，因素水平安排見表1，L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)詳見表2。

表1 各因素水平

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 本次結(jié)果分析采用加權(quán)評(píng)分法，將芍藥苷轉(zhuǎn)移率、出膏率的權(quán)益系數(shù)分別取為0.5。分別把每項(xiàng)最高的指標(biāo)定為100分，最低的定為0分。如將芍藥苷轉(zhuǎn)移率最佳的2號(hào)實(shí)驗(yàn)77.19定為100分，最低的1號(hào)試驗(yàn)35.02定為0分，則每升高(77.19-35.02)/100=0.4217即增加1分；同理可推得出膏率每升高(33.33-17.54)/100=0.1579即增加1分。

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析(見表2、表3)，可知，提取次數(shù)和醇濃度對(duì)提取效率影響較大，并具有顯著性差異，而提取時(shí)間及料液比對(duì)其結(jié)果影響較小。因此將兩者結(jié)果綜合考慮得桃紅四物湯的最佳醇提工藝為A2B2C3D2，即加8倍量70%醇，提取3次，每次1h。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 為考察上述優(yōu)選提取工藝的穩(wěn)定性，按該工藝條件進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)(n=3)，分別測(cè)定芍藥苷的轉(zhuǎn)移率及出膏率。試驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝合理可行，重現(xiàn)性較好，驗(yàn)證結(jié)果見表4。

3 討論

在測(cè)定芍藥苷的含量時(shí)，結(jié)合芍藥苷在酸性環(huán)境中較在堿性環(huán)境下穩(wěn)定的特性，分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液等流動(dòng)相[7,8]，結(jié)果顯示，加了磷酸后的流動(dòng)相，基線噪音小，芍藥苷的峰型較好，且陰性對(duì)照無干擾；對(duì)比甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液后，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.05%磷酸溶液條件下的色譜峰峰型較差，因此采用乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相，得到的色譜圖基線平穩(wěn)，芍藥苷所屬的峰保留時(shí)間適宜且分離效果較好。

表3 方差分析

注：F0.05(2,2)=19

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

本文采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法，以芍藥苷轉(zhuǎn)移率和出膏率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選桃紅四物湯的醇提工藝，采用加權(quán)求和的綜合評(píng)價(jià)方法，選出最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，此工藝穩(wěn)定、可行。

[1] 王康鋒,邱振剛.桃紅四物湯[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2005.

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(責(zé)任編輯：魏 曉)

Optimization of Alcohol Extraction Process for Granule of Taohong Siwu Decoction by Orthogonal Test

Li Peipei1,2，Wang Tongsheng3，Wu DeLing1,2*，Zhang Wei1,2，Ma Fengai1,2，Song Jie1,2，Zuo Ya-feng1,2，Qiao Jinwei1,2

(1.School of Pharmacy，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230031，China；2.Anhui Key laboratory of Modern Chinese Medicines，Hefei 230031，China；3.School of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230038，China)

Objective:To optimize the alcohol extraction technology for Granule of Taohong Siwu Decoction.Methods:An orthogonal test was employed to observe the influences of the ethylalcohol volume, the ethanol concentration, extraction times and extraction time on the transfer rate of paeoniflorin, and the yield of dry extracts of Taohong Siwu Decoction. Results:The optimized extracting process was as follows: Adding 8 times of the mount of 70% ethylalcohol, extracting 3 times, and extracting for 1h per time. Conclusion:The optimized process can be used for extracting active components from Taohong Siwu Decoction because of its being stable, reasonable, and feasible.

Taohong Siwu Decoction；Paeoniflorin；Orthogonal Test；Extracting Technology

2014-07-25

省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(AH201310369054)

李培培(1989-)，女，安徽中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化研究。

吳德玲(1973-)，男，安徽中醫(yī)藥大學(xué)教授，研究方向?yàn)橹兴幓钚猿煞盅芯俊⒅兴庂|(zhì)量評(píng)價(jià)研究和中藥新藥的研究與開發(fā)。

R284

A

1673-2197(2014)23-0019-03