熊 瑞，胡昌江，趙 玲，耿媛媛，潘 新

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137)

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淫羊藿油炙前后及分別組成二仙湯后對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠溫腎助陽(yáng)作用比較研究

熊 瑞，胡昌江*，趙 玲，耿媛媛，潘 新

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137)

目的：比較淫羊藿油炙前后及分別組成二仙湯后對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠臟器指數(shù)、自主活動(dòng)變化和血清睪酮的影響，探討生、炙淫羊藿溫腎助陽(yáng)作用的差異。方法：采用氫化可的松所致的腎陽(yáng)虛小鼠模型，比較淫羊藿油炙前后及分別組成二仙湯后對(duì)小鼠臟器指數(shù)(睪丸、精囊腺、包皮腺、胸腺)、自主活動(dòng)變化及血清睪酮變化的影響，分析油炙前后淫羊藿溫腎助陽(yáng)功效的差異。結(jié)果：與模型組相比，淫羊藿生品、炙品及二仙湯生品、炙品均具有極顯著升高血清睪酮的作用(P<0.01)，且炙品升高效果顯著強(qiáng)于生品(P<0.05)；除模型組外，各組小鼠臟器指數(shù)(睪丸、胸腺、包皮腺和精囊腺)和自主活動(dòng)性均有顯著改善(P<0.05～0.01)。結(jié)論：淫羊藿油炙前后及分別組成二仙湯后對(duì)氫化可的松所致腎陽(yáng)虛小鼠臟器指數(shù)、血清睪酮和自主活動(dòng)變化均具有較明顯改善作用，且淫羊藿油炙后溫腎助陽(yáng)作用強(qiáng)于生品。

淫羊藿；油炙；腎陽(yáng)虛；臟器指數(shù)；血清睪酮

淫羊藿的本草文獻(xiàn)初見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，關(guān)于淫羊藿的炮制方法最早見(jiàn)于《雷公炮炙論》：“凡使(時(shí)呼仙靈脾)，需用夾刀去葉、四畔花(枝)盡后，細(xì)銼，用羊脂相對(duì)拌炒過(guò)，待羊脂四兩為度也[1]”。此法在歷代資料中均有記載，且1977-2010版《中華人民共和國(guó)藥典》(后簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》)均只記載此法。淫羊藿生品性辛、甘、溫，歸肝、腎經(jīng)，因羊脂油甘溫，能溫散寒邪、補(bǔ)腎助陽(yáng)，故油炙后能增強(qiáng)其溫腎助陽(yáng)的作用。中醫(yī)臨床常將其與仙茅、當(dāng)歸、巴戟天、黃柏和知母組成二仙湯，具有溫腎陽(yáng)、補(bǔ)腎精、瀉腎火和調(diào)理沖任的功效。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較淫羊藿油炙前后對(duì)氫化可的松所致腎陽(yáng)虛小鼠模型溫腎壯陽(yáng)作用的差異，擬從臟器指數(shù)、自主活動(dòng)性、自主站立性和血清睪酮含量改變等方面進(jìn)行比較研究，初步探討油炙對(duì)淫羊藿溫腎助陽(yáng)作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，雄性，體重18～22g，普通級(jí)，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK(川)2008-24)。小鼠于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)(許可證號(hào)：川實(shí)動(dòng)管第015號(hào))，國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中觀察(NO.TCM-2009-324)。

1.2 藥物與試劑

淫羊藿、黃柏、知母、仙茅、巴戟、當(dāng)歸均購(gòu)自荷花池中藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室盧先明教授鑒定為真品，均為2010版《中國(guó)藥典》收載品種。實(shí)驗(yàn)室前期分別對(duì)已購(gòu)得的淫羊藿EpimediumbrevicornuMaxim和箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim進(jìn)行入藥標(biāo)準(zhǔn)的考察，結(jié)果表明淫羊藿在總黃酮含量、淫羊藿苷含量、醇浸出物等指標(biāo)方面均高于箭葉淫羊藿，且已有文獻(xiàn)報(bào)道[4]淫羊藿化學(xué)成分較穩(wěn)定，箭葉淫羊藿種內(nèi)質(zhì)量差異較大，故本實(shí)驗(yàn)選擇淫羊藿作為實(shí)驗(yàn)藥物。

油炙淫羊藿采用課題組前期研究的最佳工藝：溫度160℃，時(shí)間為7min(每100kg淫羊藿消耗羊脂油煉油20kg)[3]。藥液制備：取淫羊藿生品和炙品并分別組成二仙湯，加12倍水浸泡0.5h，煎煮1h，過(guò)濾，濾渣再加12倍量水，煎煮2次，每次1h，過(guò)濾，合并藥液，減壓濃縮至相應(yīng)濃度。

氫化可的松(規(guī)格5mg·mL-1)：太極西南藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)121103；氯化鈉注射液(0.9%)：四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)M12120821；金匱腎氣丸：北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號(hào)1030582；小鼠睪酮(T)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(96T)：上海尚樂(lè)生物科技有限公司，批號(hào)201306。

1.3 儀器

ZZ-6小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀(成都泰盟科技有限公司)；LT502型電子天平(常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司)；AR862A型紅外測(cè)溫儀(?，擲MART SENSOR)；離心機(jī)(上海安婷科學(xué)儀器廠)；酶標(biāo)儀(芬蘭 Labsystems Multiskan MS，型號(hào)：352型)；洗板機(jī)(芬蘭Thermo Labsystems，型號(hào)：AC8型)；離心機(jī)(國(guó)產(chǎn)微量高速離心機(jī)，型號(hào)：TG16W 型)；培養(yǎng)箱(國(guó)產(chǎn)隔水式恒溫培養(yǎng)箱，型號(hào)：GNP-9080型)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模方法 取健康雄性KM小鼠若干，正常組小鼠(13只)每天按0.1mL/20g劑量注射等體積NaCl注射液，其余造模動(dòng)物每天于皮下注射氫化可的松注射液(25mg·kg-1)，連續(xù)注射7天，停藥6天。動(dòng)物在造模期間出現(xiàn)死亡，且造模動(dòng)物出現(xiàn)活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、弓背蜷縮、體毛稀疏、無(wú)光澤、飲食飲水量減少等現(xiàn)象，說(shuō)明造模成功[5]。

1.4.2 分組 取符合上述表現(xiàn)的造模小鼠若干，隨機(jī)分為14組：模型組、金匱腎氣丸組(5g·kg-1)，生品低、中、高劑量組(6g·kg-1，12g·kg-1，24g·kg-1)，炙品低、中、高劑量組(6g·kg-1，12g·kg-1，24g·kg-1)，二仙湯生品低劑量組(8g·kg-1，16g·kg-1，32g·kg-1)，二仙湯炙品低劑量組(8g·kg-1，16g·kg-1，32g·kg-1)，每組13只。

1.4.3 給藥方法 第14天開(kāi)始，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠每日按0.2mL/10g劑量灌胃純凈水，其余各組小鼠每日均等體積灌胃給藥，連續(xù)給藥14天。

1.4.4 血清睪酮及臟器指數(shù)測(cè)定方法 于第28天末次給藥1h后，用眼眶取血法采集各組小鼠血液，分離血清(3 000rpm，10min)，-20℃保存待測(cè)，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定血清睪酮含量。小鼠取血后處死，精確剝?nèi)⌒∈蟛G丸、精囊、包皮腺和胸腺，精確稱(chēng)濕重。

1.4.5 自主活動(dòng)性和自主站立性測(cè)定方法 從造模開(kāi)始，每30天稱(chēng)1次體重，稱(chēng)重后，于造模前、造模后與給藥后分別采用自主活動(dòng)儀測(cè)定10min內(nèi)小鼠自發(fā)自主活動(dòng)次數(shù)和自主站立次數(shù)。將小鼠放入自主活動(dòng)儀內(nèi)，前3min為適應(yīng)期，后10min由計(jì)數(shù)儀統(tǒng)計(jì)小鼠自主活動(dòng)次數(shù)。觀察指標(biāo)為其自主活動(dòng)性和自主站立性的變化情況。

自主活動(dòng)數(shù)變化=(藥后活動(dòng)數(shù)-藥前活動(dòng)數(shù))/藥前活動(dòng)數(shù)；

自主站立數(shù)變化=(藥后站立數(shù)-藥前站立數(shù))/藥前站立數(shù)；

臟器指數(shù)=臟器重量絕對(duì)值(g)/小鼠重量(g)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 對(duì)血清睪酮的影響

與模型組相比，淫羊藿生、炙品組及二仙湯生、炙品各劑量組小鼠血清睪酮含量均極顯著性升高(P<0.01)；與等劑量淫羊藿生品組相比，中、高劑量淫羊藿炙品組小鼠血清睪酮含量顯著升高(P<0.05)；與等劑量二仙湯生品組相比，中、高劑量二仙湯炙品組小鼠血清睪酮含量顯著升高(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，淫羊藿生、炙品無(wú)論是單味使用還是納入二仙湯，均對(duì)腎陽(yáng)虛造成的血清睪酮下降有顯著改善作用，且炙品的作用明顯強(qiáng)于生品，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)臟器指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組比較，其余各組小鼠睪丸、胸腺及包皮腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)。睪丸指數(shù)：與模型組相比，淫羊藿炙品高劑量組、二仙湯生品生品高劑量及二仙湯炙品高劑量組小鼠睪丸指數(shù)顯著升高(P<0.05～0.01)；精囊腺指數(shù)：與模型組相比，二仙湯生品及炙品高劑量組小鼠精囊腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)；胸腺指數(shù)：與模型組相比，二仙湯炙品高劑量組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)；包皮腺指數(shù)：與模型組相比，淫羊藿生品高劑量、淫羊藿炙品高劑量及二仙湯炙品高劑量小鼠包皮腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)。結(jié)果提示，用氫化可的松復(fù)制腎陽(yáng)虛模型，可致小鼠睪丸、胸腺及包皮腺指數(shù)明顯降低，且淫羊藿油炙前后及組成二仙湯后在到達(dá)一定劑量時(shí)可明顯改善小鼠臟器指數(shù)，生品與炙品淫羊藿的溫腎助陽(yáng)功效差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但部分指數(shù)可見(jiàn)淫羊藿炙品改善效果更顯著，可認(rèn)為炙淫羊藿有優(yōu)于生品的趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 對(duì)自主活動(dòng)性和自主站立性的影響

自主活動(dòng)性：與模型組相比，炙品低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠自主活動(dòng)性顯著提高(P<0.05～0.01)，生品中劑量組、高劑量組小鼠極顯著提高(P<0.01)；炙品與生品在改善小鼠自主活動(dòng)性和自主站立性方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但炙品起效劑量降低，在低劑量時(shí)已開(kāi)始表現(xiàn)出差異，說(shuō)明炙品作用有強(qiáng)于生品的趨勢(shì)；與模型組相比，二仙湯生品組、炙品組各劑量組小鼠自主活動(dòng)性和自主站立性均有極顯著提高(P<0.01)，但二仙湯生品組和炙品組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 生、炙淫羊藿及納入二仙湯對(duì)血清睪酮含量影響 (±s)

注：模型組與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；各給藥組與模型組比較，##P<0.01。

表2 對(duì)臟器指數(shù)的影響 (±s,×10-3)

注：模型組與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；各給藥組與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

自主站立性：與模型組相比，生、炙品中、低劑量均能在一定程度上提高小鼠自主站立性(P>0.05)，炙品高劑量組小鼠自主站立性顯著提高(P<0.05)，雖然生、炙品在提高自主活動(dòng)性和自主站立性方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但唯有炙品高劑量組出現(xiàn)顯著差異，未在生品中有所體現(xiàn)，因此在一定程度上說(shuō)明炙品作用有強(qiáng)于生品的趨勢(shì)；與模型組相比，二仙湯生品、炙品中、低劑量均能在一定程度上提高小鼠自主站立性(P>0.05)，二仙湯生、炙品高劑量組小鼠自主活動(dòng)性均有顯著性提高(P<0.05)，二仙湯生、炙品在提高小鼠自主活動(dòng)性和自主站立性方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 對(duì)自主活動(dòng)性的影響 (±s)

注：各給藥組與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，淫羊藿油炙前后及分別組成二仙湯后均對(duì)氫化可的松所致腎陽(yáng)虛小鼠血清睪酮含量下降有顯著的改善作用，且油炙品作用明顯強(qiáng)于生品；對(duì)氫化可的松致小鼠腎陽(yáng)虛模型的臟器指數(shù)(睪丸、包皮腺、胸腺和精囊腺)均有明顯改善，但油炙品作用有強(qiáng)于生品的趨勢(shì)；對(duì)腎陽(yáng)虛模型小鼠自主活動(dòng)性和自主站立性亦有明顯改善，油炙品的作用有強(qiáng)于生品的趨勢(shì)。

綜上所述，炙淫羊藿的溫腎助陽(yáng)作用優(yōu)于生品淫羊藿，且生、炙淫羊藿均有溫腎助陽(yáng)的功效，這與《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]上所述“味辛、寒”有一定的出入，與淫羊藿油炙后增強(qiáng)溫腎陽(yáng)作用的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)一致，可為臨床合理選用淫羊藿炮制品提供一定的依據(jù)。

[1] 雷敩.雷公炮炙論[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1985:97.

[2] 清·顧光重輯.神農(nóng)本草經(jīng)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1955.

[3] 周一帆,胡昌江,余凌英,等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選淫羊藿油炙工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(16):16-18.

[4] 郭寶林,肖培根.中藥淫羊藿主要種類(lèi)評(píng)述[J].中國(guó)中藥雜志,2003,28(4):303-307.

[5] 劉俊達(dá).韭菜子鹽炙前后溫補(bǔ)腎陽(yáng)的機(jī)理研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué),2011.

[6] 李寅超,黃蘭嵐,趙宜紅,等.不同煉制溫度和用量的羊脂油制淫羊藿對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2011,36(16):2250-2254.

[7] 牛銳.淫羊藿炮制前后對(duì)小鼠血漿睪酮及附性器官的影響[J].中國(guó)中藥雜志,1989,14(9):18.

[8] 劉俊達(dá).韭菜子鹽炙前后溫補(bǔ)腎陽(yáng)的機(jī)理研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué),2011.

[9] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].第1部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Comparative Study on the Effect of the Crude and Mutton-Fat-Processed Epimedii Folium in Er’xian Decoction on Nourishing and Warming Kidney-yang

Xiong Rui, Hu Changjiang*, Zhao Ling, Geng Yuanyuan, Pan Xin

(College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Objective:To compare the effect of the crude Epimedii folium, mutton-fat-processed Epimedii folium and Er’xian Decoction (EXD) containing the two respectively on organ coefficient, locomotor activity and Serum testosterone, for discussing the difference of the crude and the mutton-fat-processed. Methods:To adopt murine model of kidney-yang asthenia caused by hydrocortisone and analyze the distinction of the crude and the mutton-fat-processed through comparing organ coefficient (testis, seminal vesicle, preputial glands and thymus), locomotor activity and the level of serum testosterone(ST). Results:Compared with normal control group, the level of ST significantly increased in the crude, mutton-fat-processed and EXD containing the two respectively (P<0.01), and the mutton-fat-processed are more effective than the crude. Organ coefficient (testis, seminal vesicle, preputial glands and thymus) and locomotor activity were significant improved(P<0.05～0.01).Conclusion:The crude, mutton-fat-processed Epimedii folium and EXD containing the two respectively can improve organ coefficient, locomotor activity and the level of ST, moreover, the mutton-fat-processed is better.

Epimedii Folium; Mutton-Fat-Processed; Nourishing and Warming Kidney-yang; Organ Coefficient; Serum Testosterone

2014-07-10

中醫(yī)藥行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(20110700717)

熊瑞(1991-)，女，成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幣谥茖W(xué)。

作者簡(jiǎn)介：胡昌江(1952-)，男，成都中醫(yī)藥大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幣谥茖W(xué)教學(xué)及科研。

R285.5

A

1673-2197(2014)22-0005-03