【關(guān)鍵詞】 腦缺血再灌注損傷；肝素結(jié)合蛋白；大鼠

【中圖分類號】R245.31 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）09-0145-01

肝素結(jié)合蛋白（HBP）作為多形核白細(xì)胞分泌的重要顆粒蛋白，因其具有顯著的殺菌活性、趨化特性以及炎癥調(diào)節(jié)作用，越來越引起研究者的重視。多項研究表明，HBP與感染性疾病相關(guān)蛋白有關(guān)聯(lián)，相互作用參與多種因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，HBP究竟在腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機制中發(fā)揮怎樣的作用？國內(nèi)外鮮為報道。本文通過檢測大鼠腦組織I/R損傷后腦組織HBPmRNA及Caspase-1mRNA的動態(tài)表達(dá)及神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，旨在研究HBP在大鼠腦I/R損傷中的作用及意義。

1 材料與方法

1. 1 動物模型制備 健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量為（400±20）g，由南華大學(xué)動物實驗部提供。隨機分為假手術(shù)組（8只）和腦缺血再灌注組（32只）。后者再分為再灌注6、12、24及72h四組（n=8）。采用改良的Longa線栓法建立大鼠局灶腦缺血再灌注損傷模型。具體步驟參考陸伶俐的研究方法。假手術(shù)組除不插入線栓外，余處理相同。每組隨機取8只大鼠于不同時間窗麻醉后立即處死.迅速在冰臺上分離出海馬組織并置于液氮中保存。組織用于RT-PCR檢測。

1. 2 腦組織HBPmRNA及Caspase-1mRNA的測定

腦組織HBP、Caspase-1基因采用實時熒光RT-PCR分析：引物序列及擴增反應(yīng)條件見表1及表2，不同時間窗提取腦組織總RNA，cDNA的合成嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，以UVP計算機圖像掃描分析系統(tǒng)測定電泳條帶A值，以β-actin為內(nèi)參照，計算HBP及Caspase-1mRNA相對水平，結(jié)果以分別HBP及Caspase-1mRNA條帶與β-actin條帶A的比值表示。

1.3 細(xì)胞凋亡的檢測 末端原位標(biāo)記（ TUNEL）試劑盒購自德國寶靈曼公司，操作按說明書步驟進(jìn)行。光學(xué)顯微鏡下神經(jīng)元胞核中有棕黃色顆粒的為TUNEL陽性細(xì)胞。每張切片于梗死灶周圍選擇10個表達(dá)最強的HP計數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件， 數(shù)據(jù)以？x±s表示，采用One-Way ANOVA檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 不同時相腦缺血再灌注模型大鼠組織HBPmRNA、Caspase-1mRNA的表達(dá)及及TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)的比較

大鼠腦I/R損傷組各組均可見到明顯的細(xì)胞凋亡且假手術(shù)組中未見到TUNEL陽性細(xì)胞。腦I/R損傷后6h即有細(xì)胞凋亡，于72h達(dá)到高峰；假手術(shù)組中Caspase-1mRNA有少許表達(dá)。腦I/R損傷后隨I/R時間延長其表達(dá)逐漸上升，于72h達(dá)到高峰，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0. 05）；腦I/R損傷后HBPmRNA表達(dá)隨I/R時間延長其表達(dá)逐漸上升，于72h達(dá)到最高值，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0. 05）。見表1.

2. 2 相關(guān)性分析

腦缺血再灌注模型大鼠組織HBPmRNA表達(dá)與Caspase-1mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.32，P<0. 05）。

3 討論

凋亡在腦缺血/再灌注損傷發(fā)病機制中的發(fā)揮關(guān)鍵的作用。Caspase-1蛋白激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而執(zhí)行細(xì)胞凋亡。Caspase-1蛋白激活后破壞細(xì)胞完整性，損壞DNA鏈，最后啟動程序性凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠腦I/R12h時Caspase-1mRNA表達(dá)至高峰，隨著時間延長其表達(dá)呈上升趨勢，結(jié)合神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率在I/R后72h至高峰，提示I/R后Caspase-1mRNA表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

早期的研究證實HBP進(jìn)入細(xì)胞后聚集在線粒體區(qū)域，通過與經(jīng)典的死亡受體平行的線粒體途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，這與細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)一致。該過程考慮可能與線粒體外膜的Bcl-2、Bax、Bak有關(guān)[1]。本實驗中，我們觀察到腦I/R組BHPmRNA表達(dá)上升，于I/R72h最高，并且腦I/R組中BHPmRNA表達(dá)與S組相比各時點均明顯升高，提示BHPmRNA表達(dá)升高與腦缺血再灌注損傷的耐受性降低密切相關(guān)。同時本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注模型大鼠組織BHPmRNA表達(dá)與Caspase-1mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者存在相互作用或正性調(diào)節(jié)作用從而加速病情的惡化和進(jìn)展。

因此，深入的研究HBP分子的作用機理，尤其在減輕腦缺血再灌注后的凋亡作用機制的不斷明確，將為臨床的治療和開發(fā)提供更多、更有效的藥物靶點治療。

參考文獻(xiàn)

[1]王亮，馬曉春. 肝素結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特點及其在膿毒癥中的作用 [J].中華危重病急救醫(yī)學(xué)雜志，2012，26（3）：200-203.