摘要：建立滇桂艾納香膠囊的微生物限度檢驗(yàn)方法。采用常規(guī)法對(duì)樣品進(jìn)行方法驗(yàn)證。結(jié)果五種規(guī)定試驗(yàn)菌的回收率均不低于70%，可用于滇桂艾納香膠囊的微生物限度檢驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：滇桂艾納香膠囊；微生物限度檢查；方法驗(yàn)證 【中圖分類(lèi)號(hào)】R285 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1672-8602(2014)03-0197-01

滇桂艾納香膠囊具有活血化瘀，止血調(diào)經(jīng)。用于瘀血阻滯所致的月經(jīng)量多，經(jīng)期延長(zhǎng)。主要成份為滇桂艾納香。根據(jù)其制劑用藥途徑，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)的測(cè)定、及控制菌——大腸埃希菌檢查。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究，確定采用常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、大腸埃希菌檢查。經(jīng)對(duì)所確定的方法進(jìn)行驗(yàn)證，符合2010年版《中國(guó)藥典》一部附錄ⅧC有關(guān)微生物限度檢查法有關(guān)規(guī)定，方法可行。

1 實(shí)驗(yàn)儀器、試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種:枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003。

1.2 樣品：風(fēng)濕靈片

1.3 培養(yǎng)基及稀釋劑:營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL），改良馬丁培養(yǎng)基，MUG培養(yǎng)基，曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基， pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液等。

1.4 儀器:培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌器等。

2 細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定方法的建立及驗(yàn)證

2.1 菌液制備:取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加10 ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用。

2.2 供試液的制備方法:常規(guī)法：取樣品10g，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1：10的供試液；取1：10的供試液1ml注皿。

2.3 回收率試驗(yàn):試驗(yàn)組：同2.2，另分別取各試驗(yàn)菌50～100CFU，分別注入同一平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72h。菌液組：取試驗(yàn)菌50～100CFU注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72h，測(cè)定所加入的試驗(yàn)菌數(shù)，平行制備2個(gè)平皿。供試品對(duì)照組：同2.2，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～48h，霉菌和酵母菌培養(yǎng)48～72h，測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

2.4 方法的確定:選用金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為敏感菌株進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果：金黃色葡萄球菌回收率為93%，白色念珠菌回收率為86%，表明風(fēng)濕靈片對(duì)細(xì)菌、真菌沒(méi)有抑制作用，采用常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定可行。pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋劑無(wú)抑菌作用，對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾。

2.5 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證:取3個(gè)批號(hào)滇桂艾納香膠囊樣品，細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)按常規(guī)法進(jìn)行加菌回收率試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1

批號(hào) 回收率

大腸埃希菌 枯草芽孢桿菌 金黃色葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉

11030180% 84% 90%98% 85%

11040190%94%92% 93% 100%

11050195%90% 92% 90%96%

三個(gè)批號(hào)樣品的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，以常規(guī)法進(jìn)行滇桂艾納香膠囊細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)測(cè)定，五種規(guī)定試驗(yàn)菌的回收率均大于70%，符合《中國(guó)藥典》的規(guī)定，方法可行。確定滇桂艾納香膠囊細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法為常規(guī)法。

3 控制菌檢驗(yàn)方法的建立及驗(yàn)證

菌液制備同2.1。

3.1 大腸埃希菌檢查方法:常規(guī)法：取1：10供試液10ml接種至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基，同時(shí)加入大腸埃希菌10～100CFU，35℃培養(yǎng)24～48h。取培養(yǎng)物0.2ml接種至含5ml MUG培養(yǎng)基的試管中，35℃培養(yǎng)24h左右，366nm紫外燈下觀察熒光，然后進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)，觀察結(jié)果；另取培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)（EMB）平板，35℃培養(yǎng)18～24h，觀察其菌落形態(tài)。

3.2 大腸埃希菌試驗(yàn)結(jié)果:經(jīng)膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基培養(yǎng)后，試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比較有明顯的變化，試驗(yàn)組有明顯產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，結(jié)果如表2

大腸埃希菌 試驗(yàn)組 陽(yáng)性對(duì)照 陰性對(duì)照

BL - + ―

MUG，靛基質(zhì) - - + ―

EMB平板 -+―

4 結(jié)語(yǔ)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，擬定滇桂艾納香膠囊微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)正文如下：微生物限度 照微生物限度檢查法（《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅪJ）。取本品10g，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液制成1：10的供試液。細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、大腸埃希菌 取1：10的供試液，采用常規(guī)法，依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。細(xì)菌數(shù)每1g不得過(guò)1000cfu，霉菌和酵母菌數(shù)每1g不得過(guò)100cfu，大腸埃希菌每1g不得檢出。

5 三批滇桂艾納香膠囊的微生物限度檢查

按上述所建立的滇桂艾納香膠囊微生物限度檢查法，對(duì)三批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3

批號(hào) 細(xì)菌數(shù)霉菌、酵母菌數(shù) 大腸埃希菌 結(jié)論

110301 120個(gè)/g15個(gè)/g 未檢出 符合規(guī)定

110401 80個(gè)/g10個(gè)/g 未檢出 符合規(guī)定

110501 90個(gè)/g 20個(gè)/g未檢出 符合規(guī)定

參考文獻(xiàn)

[1] 2010年版《中國(guó)藥典》一部.