摘要：目的 探討瑞舒伐他汀對(duì)ApoE基因缺陷小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-Smooth muscle actin， α-SMA）表達(dá)的影響。研究瑞舒伐他汀抗動(dòng)脈粥樣硬化（AS）降脂外的可能機(jī)制。方法 將20只6 w齡雄性ApoE基因缺陷小鼠隨機(jī)分為兩組：陽性對(duì)照組10只，予高脂飼料和飲水；瑞舒伐他汀組10只，予高脂飼料、飲水和瑞舒伐他汀10 mg/Kg/d； 另設(shè)同周齡野生雄性小鼠10只作為陰性對(duì)照組：予普通飼料、飲水喂養(yǎng)。三組小鼠喂養(yǎng)13 w后，摘出眼球并測(cè)定血清中總膽固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）的水平等生化指標(biāo)。然后處死小鼠并取出主動(dòng)脈（從主動(dòng)脈弓起始到腹主動(dòng)脈分支處），常規(guī)HE染色及免疫組織化學(xué)染色，觀察主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化和血管壁斑塊組織變化，定量分析斑塊面積與管腔面積之比（PA/LA）、血管內(nèi)膜厚度（IMT），定性分析α-SMA表達(dá)強(qiáng)度的變化。結(jié)果 6 w齡ApoE基因缺陷雄性小鼠喂養(yǎng)13 w后，與陽性對(duì)照組比較，瑞舒伐他汀組血清TCH、TG、LDL-C水平顯著降低，兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；病理測(cè)定PA/LA及IMT，瑞舒伐他汀組較陽性對(duì)照組明顯減小，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與陽性對(duì)照組比較，瑞舒伐他汀組血管壁組織α-SMA表達(dá)減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 瑞舒伐他汀可減少動(dòng)脈粥樣硬化病變中α-SMA表達(dá)，其抗動(dòng)脈粥樣硬化降脂外作用可能為阻止血管平滑肌細(xì)胞向動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中遷移有關(guān)。

關(guān)鍵詞：瑞舒伐他汀，ApoE基因缺陷小鼠，AS，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是眾多心腦血管疾病共同的病理生理基礎(chǔ)，也是心血管系統(tǒng)疾病中最常見的疾病，嚴(yán)重危害人類疾病。目前他汀類藥物已被公認(rèn)為具有抗AS作用，越來越多的研究表明它在抗AS的形成和發(fā)展方面，除了降脂作用外還有很多調(diào)脂外的抗AS機(jī)制，如抑制血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的遷移和增殖。血管a-SMA屬于細(xì)胞骨架微絲的基本成分之一，特異性的在VSMC中表達(dá)， 其相對(duì)含量是判斷VSMC表型的重要指標(biāo)。收縮表型細(xì)胞中主要以α-SAM為主，VSMC中α-SAM的減少提示細(xì)胞由收縮表型向增殖表型轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)通過觀察瑞舒伐他汀對(duì)AS板塊中α-SAM表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其抗AS的降脂外作用。

1資料與方法

1.1藥物和動(dòng)物試驗(yàn)資料

1.1.1動(dòng)物 健康野生型雄性小鼠10只，APOE基因缺陷雄性小鼠20只，體重18.5～21.1 g，購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2藥物 瑞舒伐他汀，商品名可定，由阿斯利康制藥有限公司提供。

1.1.3飼料 基礎(chǔ)飼料及高脂飼料均由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料廠提供。高脂飼料配方：10%豬油，2%膽固醇，0.2%膽酸鈉，87.8%普通飼料。

1.1.4主要試劑及儀器 TC、TG、LDL-C試劑盒，由江蘇建成公司生產(chǎn)。光鏡病理試劑均由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。ABC免疫組化染色試劑盒、日立7600-010全自動(dòng)生化分析儀、日本歐林巴斯彩色病理圖像分析系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理 陰性對(duì)照組：6 w齡雄性野生型小鼠10只，給普通飼料、飲水喂養(yǎng)。將20只6 w齡APOE基因缺失雄性小鼠隨機(jī)分為兩組：陽性對(duì)照組10只，予高脂飲食、飲水；瑞舒伐他汀組10只，給予高脂飲食、飲水和瑞舒伐他汀10 mg/Kg/d。三組喂養(yǎng)時(shí)間均為13 w。

1.2.2樣本采集 樣本采集前12 h禁飲禁食，小鼠麻醉后，經(jīng)眼眶取血，分離血清，測(cè)定血脂等生化指標(biāo)。處死小鼠，取出主動(dòng)脈（自主動(dòng)脈弓至腹主動(dòng)脈分叉處），生理鹽水沖洗，4%甲醛中固定。常規(guī)石蠟包埋，從主動(dòng)脈弓部起間斷均勻切片，切片厚度為5 um，每只取5張切片。

1.2.3生化指標(biāo)檢測(cè) 血樣送南京市第一醫(yī)院生化室全自動(dòng)數(shù)字生化分析儀測(cè)定血脂等。

1.2.4病理學(xué)測(cè)定 病理學(xué)測(cè)定在南京市第一醫(yī)院病理科完成，每組隨機(jī)取5個(gè)標(biāo)本進(jìn)行蘇木素-伊紅染色（HE染色），普通光鏡觀察形態(tài)學(xué)改變；每個(gè)標(biāo)本取2張切片（每隔2張取1張）用纖維彩色圖像處理，共計(jì)10個(gè)視野進(jìn)行測(cè)量統(tǒng)計(jì)，測(cè)量指標(biāo)包括：斑塊面積與管腔面積之比（PA/LA）；血管內(nèi)膜厚度（IMT）。每組選用五個(gè)斑塊較明顯的做統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5免疫組化 免疫組化在南京市第一醫(yī)院病理科完成。檢測(cè)通過ABC法染色，觀察各組主動(dòng)脈血管壁斑塊組織α-SMA表達(dá)水平。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本實(shí)驗(yàn)所檢驗(yàn)變量均為連續(xù)性變量，且經(jīng)SPSS的P-P圖檢驗(yàn)后均符合正態(tài)分布，故各數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較首先行方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊使用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal Wallistest），方差齊采用方差分析。方差分析檢驗(yàn)結(jié)果示各組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后運(yùn)用SNK法檢驗(yàn)進(jìn)行所有組間的兩兩比較。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2結(jié)果

2.1各組血脂結(jié)果 與陰性對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組、瑞舒伐他汀TCH、TG及LDL-C均明顯升高（P<0.05），提示ApoE基因缺陷小鼠存在明顯血脂紊亂；與陽性對(duì)照組相比，瑞舒伐他汀組TCH、TG、LDL-C降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有意義（P<0.05），見表1。

2.2病理形態(tài)學(xué)改變及病理測(cè)定 陰性對(duì)照組小鼠動(dòng)脈血管各層結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜薄，由單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成。陽性對(duì)照組內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)含較多的泡沫細(xì)胞，VSMC向內(nèi)膜突起。瑞舒伐他汀干預(yù)組較陽性對(duì)照組病變有明顯較輕。見圖1。

2.3小鼠主動(dòng)脈α-SMA的表達(dá) 陰性對(duì)照組小鼠血管壁細(xì)胞漿內(nèi)有黃褐色顆粒狀物表達(dá)；陽性對(duì)照組血管壁及AS斑塊表面胞質(zhì)中有大量棕黃色顆粒，比陰性對(duì)照組表達(dá)更明顯；瑞舒伐他汀組血管壁及AS斑塊表面胞質(zhì)中棕黃色顆粒較陽性對(duì)照組少，但比陰性對(duì)照組多，見圖2。

3討論

瑞舒伐他汀是一種新型、安全、高效、化學(xué)合成的最具成本效益比的劑效依賴性的他汀類降脂藥物， 是目前降低LDLC作用最強(qiáng)的調(diào)脂藥物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與陽性對(duì)照組比較，瑞舒伐他汀組血脂水平顯著減低（P<0.05），進(jìn)一步證明瑞舒伐他汀具有較強(qiáng)的降脂作用，與STELLAR研究[3]結(jié)果一致。

與陽性對(duì)照組比較，瑞舒伐他汀組小鼠的AS形態(tài)學(xué)改變、PA/LA及IMT均較陽性對(duì)照組明顯減輕，進(jìn)一步證明瑞舒伐他汀鈣可產(chǎn)生抗AS作用， 減少動(dòng)脈粥樣斑塊形成。陽性對(duì)照組動(dòng)脈α-SMA表達(dá)明顯高于陰性對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 提示α-SMA表達(dá)在AS的發(fā)病過程中起著重要的作用。瑞舒伐他汀鈣干預(yù)組與陽性對(duì)照組相比α-SMA表達(dá)明顯減少， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示瑞舒伐他汀抗AS的機(jī)制與減少動(dòng)脈α-SMA表達(dá)有關(guān)。Mathapati S[1]實(shí)驗(yàn)表明高膽固醇飲食喂養(yǎng)的兔AS模型中主動(dòng)脈粥樣斑塊中α-SMA的表達(dá)增加。Igarashi M[2]實(shí)驗(yàn)表明，在頸動(dòng)脈內(nèi)皮球囊剝脫的兔的AS模型中，HMG-CoA還原酶抑制劑 BAYw6228可以減少頸動(dòng)脈新生內(nèi)膜組織中α-SMA的表達(dá)、VSMC的增殖以及新生內(nèi)膜的增厚。這些結(jié)果和本實(shí)驗(yàn)都是一致的。隨著AS的發(fā)生，動(dòng)脈壁的VSMC發(fā)生增殖和遷移，增殖型VSMC有很少的α-SMA表達(dá)，有理由推測(cè)，在本實(shí)驗(yàn)中AS斑塊中發(fā)生了大量VSMC的遷移，正是這些遷移至AS斑塊中的收縮型VSMC表達(dá)了α-SMA，而瑞舒伐他汀可以阻止VSMC向AS斑塊中遷移，從而發(fā)揮抗AS的作用。至于瑞舒伐他汀是通過什么途徑阻止VSMC向AS斑塊中遷移的，暫且不甚明確，下面將設(shè)計(jì)新的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明：他汀類降脂藥抗AS機(jī)制中除了降脂作用外，還存在降脂外作用，抑制VSMC增殖及遷移是降脂外作用之一。瑞舒伐他汀具有降低血脂及減輕AS病變的作用，但與正常對(duì)照組相比，血脂水平仍偏高，仍存在AS病變，這說明在降低血脂及減輕AS病變的治療中，我們不僅需要考慮藥物的治療作用，還需注意飲食、家族遺傳的因素的影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]Mathapati S， Arumugam SB， Verma RS. High cholesterol diet increases MMP9 and CD40 immunopositivity in early atherosclerotic plaque in rabbits[J].Acta Histochem， 2010， 112（6）： 618-623.

[2]Igarashi M， Takeda Y， Mori S， et al. Suppression of neointimal thickening by a newly developed HMG-CoA reductase inhibitor， BAYw6228， and its inhibitory effect on vascular smooth muscle cell growth[J].British Journal of Pharmacology， 1997， 120： 1172 -1178.

編輯/張燕