摘要：免疫組織化學(xué)染色方法是根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合，通過(guò)熒光或化學(xué)顯色檢測(cè)細(xì)胞或組織中抗原的含量和分布，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和定位準(zhǔn)確等特點(diǎn)。本文主要從抗體孵育條件、設(shè)置合理對(duì)照、固定液的洗脫、抗原修復(fù)和洗片等步驟討論如何做好免疫組織化學(xué)染色。

關(guān)鍵詞：免疫組織化學(xué)染色；抗體；組織固定；抗原修復(fù)

免疫組織化學(xué)染色方法是目前生命領(lǐng)域研究最常用的實(shí)驗(yàn)方法之一，也是臨床病理診斷從細(xì)胞形態(tài)水平提高到分子水平的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。免疫組織化學(xué)染色方法主要應(yīng)用免疫學(xué)中抗原抗體結(jié)合的實(shí)驗(yàn)原理檢測(cè)特定抗原在細(xì)胞或組織中的表達(dá)和分布。影響免疫組織化學(xué)染色的因素有很多，而抗體孵育條件、設(shè)置合理對(duì)照、固定液的洗脫、抗原修復(fù)和洗片等可能是做好免疫組織化學(xué)染色的關(guān)鍵注意點(diǎn)。

1基本原理及特點(diǎn)

免疫組織化學(xué)染色方法是根據(jù)免疫學(xué)中抗原抗體特異性結(jié)合，通過(guò)熒光或化學(xué)顯色檢測(cè)細(xì)胞或組織中抗原的含量和分布。免疫組織化學(xué)染色法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和定位準(zhǔn)確等特點(diǎn)。目前最常用的幾種免疫組織化學(xué)染色方法主要包括免疫熒光法、免疫酶標(biāo)法和免疫膠體金技術(shù)等。免疫熒光法是將熒光素標(biāo)記的二抗和一抗結(jié)合，可在熒光顯微鏡下直接觀察細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗原的表達(dá)和分布。免疫酶標(biāo)法與免疫熒光法不同之處在于二抗的標(biāo)記方式，它用酶標(biāo)二抗代替熒光素標(biāo)記的二抗，然后通過(guò)加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，然后通過(guò)光鏡或電鏡，觀察細(xì)胞或組織內(nèi)抗原的含量和分布。免疫酶標(biāo)法包括二步法、ABC法、SP三步法等多種方法，由于其組織形態(tài)較為完整，在抗原定位上對(duì)免疫熒光法具有更大的優(yōu)勢(shì)。

2幾個(gè)關(guān)鍵注意點(diǎn)

2.1抗體孵育條件 抗體孵育是免疫組織化學(xué)染色中最關(guān)鍵的步驟，也是最核心的步驟。一個(gè)失敗的免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果大部分都與抗體孵育條件不佳有關(guān)。抗體孵育條件包括抗體稀釋濃度、孵育時(shí)間和溫度、抗體稀釋液等因素。即便是同一個(gè)抗原，在不同組織中表達(dá)豐度也有很大的差異，因此一定要根據(jù)濃度梯度選擇合適的抗體稀釋濃度。一抗孵育溫度包括4℃、室溫和37℃，4℃反應(yīng)較為溫和，效果最好。一般可選擇4℃過(guò)夜，然后37℃復(fù)溫30min～1h。二抗孵育條件一般室溫2h。室溫一般定義為25℃，如果在夏天或冬天選擇室溫孵育，需要注意室溫的溫度?？梢杂锰砑?%二抗來(lái)源血清的PBS稀釋抗體，如果抗原位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，建議用含5%二抗來(lái)源血清的TBST稀釋抗體。由于弱堿性條件有利于抗原抗體結(jié)合，因此一定要注意抗體稀釋液的PH值在7.2～7.4之間。此外，為了防止抗原抗體反應(yīng)時(shí)液體的蒸發(fā)，可在擦干組織周?chē)囊后w后，使用免疫組化筆在組織周?chē)?huà)圈，使抗體不易流失，抗原抗體的反應(yīng)過(guò)程中不干片，保證結(jié)合效率。

2.2設(shè)置合理對(duì)照 由于免疫組織化學(xué)染色中影響抗原和抗體結(jié)合的因素很多，因此必須設(shè)置對(duì)照組才能做出正確的判斷。常用的對(duì)照包括：陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照等。陽(yáng)性對(duì)照是用已證實(shí)含用待測(cè)抗原的組織進(jìn)行同樣操作，結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。通過(guò)陽(yáng)性對(duì)照可排除染色步驟以及所用的試劑的問(wèn)題。用確知不存在待檢抗原的組織切片染色為陰性對(duì)照，可排除在染色過(guò)程中由于非特異性染色或交叉反應(yīng)等因素造成的\"假陽(yáng)性\"結(jié)果。空白對(duì)照是最常用的對(duì)照，用不加一抗的緩沖液，如PBS替代一抗，染色結(jié)果應(yīng)為陰性，說(shuō)明染色方法可靠，可排除組織的的非特異性顯色或熒光。

2.3固定液的洗脫 取材新鮮、固定及時(shí)，不僅可保存組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整，而且可保留組織細(xì)胞的抗原性。固定液的選擇將直接影響免疫組化標(biāo)記的結(jié)果及病理診斷的準(zhǔn)確性[1]。然而，因固定液滲到組織中，所以必須徹底沖洗，除去固定液，否則會(huì)影響下一步的脫水和染色。由于免疫組織化學(xué)染色需要組織保存較高的抗原活性，因此一般選用PBS對(duì)固定的組織進(jìn)行浸洗，30min/次，連續(xù)浸洗3次。

2.4抗原修復(fù)固定和石蠟包埋 可使組織部分抗原決定簇與核酸或其他蛋白發(fā)生交聯(lián)，如果不進(jìn)行抗原修復(fù)可能會(huì)得到\"假陰性\"實(shí)驗(yàn)結(jié)果。常用的修復(fù)方法包括高壓修復(fù)、微波處理法和酶消化法等。通過(guò)微波抗原修復(fù)，充分暴露抗原決定簇，有利于抗原抗體結(jié)合，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般可用微波中火修復(fù)4次，5min/次，抗原修復(fù)液需預(yù)熱至修復(fù)時(shí)所需的溫度。在微波修復(fù)過(guò)程中，應(yīng)注意抗原修復(fù)液的蒸發(fā)，必須保證組織浸于液面以下，否則易造成假陰性結(jié)果。如果液體蒸發(fā)較多，可在中間及時(shí)加入預(yù)熱的抗原修復(fù)液。微波修復(fù)后需自然冷卻至室溫，一般需要30min～1h。抗原修復(fù)液的pH值對(duì)染色結(jié)果有很大影響[2，3]?？乖迯?fù)液一般采用酸性的檸檬酸修復(fù)液，酸性pH值的抗原修復(fù)液效果要好于堿性修復(fù)液，并且不易造成脫片。此外，丙酮簡(jiǎn)單處理標(biāo)本是一種方法簡(jiǎn)單、又能使組織免疫反應(yīng)活性得到明顯加強(qiáng)的方法，有時(shí)可替代復(fù)雜的抗原修復(fù)技術(shù)[3]。

2.5洗片 一般來(lái)說(shuō)可用PBST在搖床上浸洗3次，10min/次，具體浸洗時(shí)間和次數(shù)可根據(jù)染色背景進(jìn)行調(diào)整。前面已提到，弱堿性條件有利于抗原抗體結(jié)合，因此也要要注意切片漂洗液的pH值應(yīng)在7.2～7.4。對(duì)于干片對(duì)染色結(jié)果的影響，余光銀等[4]發(fā)現(xiàn)，在沖洗步驟造成的干片，對(duì)染色結(jié)果無(wú)明顯影響；而滴加抗體和抗原修復(fù)時(shí)需防止干片，否則易造成假陰性及背景染色。

影響免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的因素有很多，除了以上幾點(diǎn)需要特別關(guān)注的地方外，還有其他步驟或細(xì)節(jié)都要注意，比如組織低溫固定和脫水、固定液的選擇、石蠟切片的烤片溫度和時(shí)間、切片的低溫保存等每個(gè)細(xì)節(jié)都會(huì)影響免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的好壞。

參考文獻(xiàn)：

[1]周會(huì)芹，楊江輝，余琦，等.不同組織固定液對(duì)免疫組化結(jié)果的影響[J].診斷病理學(xué)雜志，2009，16（6）：478.

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[3]陳余明，張聲，王行富，等.不同的抗原修復(fù)方法在IV型膠原免疫組化染色中的應(yīng)用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2014，30（1）：98-100.

[4]余光銀，陳耀麗，蔡廣玲，等.干片對(duì)免疫組化染色結(jié)果的影響[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2010，17（4）：45-47.

編輯/孫杰