摘要：目的 觀察NR2F2基因的表達(dá)與鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）的關(guān)系。方法 采用實(shí)時定量rtPCR技術(shù)檢測NR2F2基因在NPC細(xì)胞株（CNE1、CNE2、58F）和鼻咽上皮細(xì)胞株（NP69）中的表達(dá)；采用組織芯片技術(shù)通過免疫組化檢測NR2F2在124例惡性鼻咽癌腫瘤、31例對應(yīng)的癌旁正常組織和12例正常鼻炎粘膜組織的表達(dá)。結(jié)果 NR2F2 mRNA在NP69中表達(dá)水平較高，而在NPC細(xì)胞株中表達(dá)水平顯著下降。正常鼻咽粘膜及癌旁組織中NR2F2蛋白染色陽性表達(dá)率約為72% （31/43）；而在鼻咽癌組織中陽性表達(dá)率約為31% （39/124）；NR2F2蛋白表達(dá)水平與腫瘤的侵犯范圍（T）呈負(fù)相關(guān)（P<0.01），與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N）無關(guān)（P>0.05）。結(jié)論 NR2F2基因表達(dá)的抑制可能參與鼻咽癌的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：NR2F2；鼻咽癌；基因表達(dá)

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國南方較高發(fā)的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害公眾健康。其病因目前尚不明確?；颊叱踉\時常伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此急需尋找能用于鼻咽癌早期診斷以及預(yù)后的生物標(biāo)志物，為早期診斷和治療提供線索。

NR2F2是1991年被識別的一個配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，為類固醇/甲狀腺激素核受體家族中的一個新成員[1]。多項(xiàng)研究表明NR2F2可參與調(diào)節(jié)多個不同基因的表達(dá)，在控制組織和器官發(fā)育的過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。近來有研究報道NR2F2在激素抵抗型乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)受抑制，且該基因的表達(dá)與腫瘤組織分型呈負(fù)相關(guān)[4-5]，表明NR2F2表達(dá)下調(diào)可能參與腫瘤發(fā)生。

本研究通過對鼻咽癌細(xì)胞株和鼻咽上皮細(xì)胞株的NR2F2基因mRNA表達(dá)水平的檢測并利用組織芯片配合免疫組化觀察NR2F2蛋白表達(dá)在鼻咽癌組織和正常及癌旁組織的差異，探討了NR2F2的表達(dá)與鼻咽癌之間的關(guān)系及其臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料 Trizol 試劑購自Invitrogen公司； 反轉(zhuǎn)錄酶購自 TaKaRa 公司；熒光定量PCR MIX（SYBR染料法）購自ABI公司。胎牛血清及 RPMI1640 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司；組織芯片NPC961和NPC962購自西安艾麗娜生物科技有限公司；兔抗人NR2F2抗體（ab50487）購于 Abcam 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購于碧云天生物公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 三株鼻咽癌細(xì)胞CNE1、CNE2、58F和一株鼻咽上皮細(xì)胞NP69由中山大學(xué)腫瘤中心康鐵邦教授惠贈；用含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基在 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 rt-PCR 檢測NR2F2 mRNA 的表達(dá) Trizol 提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa）按說明書合成cDNA。PCR 擴(kuò)增引物由華大生物技術(shù)有限公司合成： NR2F2基因引物上游： 5'- CCATAGTCCTGTTCACCTC -3'，下游： 5'- GCTCCTAACGTATTCTTCCA -3'，產(chǎn)物長度104bp； actin引物上游： 5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT -3'，下游： 5'-GCTGTCACCTTCACCTTTCC -3'，產(chǎn)物長度268 bp。采用20 μL的反應(yīng)體系，每個樣本重復(fù)3次，求平均Ct值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。反應(yīng)過程具體為： 95℃預(yù)變性3 min；95℃變性13 s，59℃退火和延伸45 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。計算ΔCT=Ct（NR2F2）-Ct（actin）；再根據(jù)ΔΔCT=ΔCT（腫瘤細(xì)胞株）-ΔCT（NP69），進(jìn)一步計算NR2F2在腫瘤細(xì)胞株與NP69之間表達(dá)倍數(shù)的差異。

1.4組織芯片及免疫組化分析 組織芯片NPC961和NPC962包含124例原發(fā)性鼻咽癌腫瘤、31例對應(yīng)的癌旁正常組織和12例正常鼻炎粘膜組織。組織芯片經(jīng)二甲苯脫石蠟，乙醇再水化，PBS清洗，至于0.01 M檸檬酸緩沖液（pH 6.0）在微波爐中加熱使抗原復(fù)活，3% H2O2中室溫浸泡10min封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，抗-NR2F2于4℃孵育過夜，滴加二抗工作液，DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染后，中性樹膠封片，于普通顯微鏡下觀察。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 計數(shù)資料相關(guān)性分析及率的比較用Pearson's χ2檢驗(yàn)或Fisher's精確檢驗(yàn)（SPSS 19.0版統(tǒng)計軟件）。

2結(jié)果

2.1 NR2F2在鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá) 為了比較NR2F2在鼻咽癌細(xì)胞和正常細(xì)胞間的表達(dá)差異，我們分別利用實(shí)時定量rt-PCR比較了高分化型鼻咽癌細(xì)胞株CNE1、低分化型鼻咽癌細(xì)胞株CNE2、高轉(zhuǎn)移型鼻咽癌細(xì)胞株58F和鼻咽上皮細(xì)胞株NP69中NR2F2的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，在正常鼻咽上皮細(xì)胞株NP69中NR2F2的mRNA表達(dá)水平較高，而在三種鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)水平均顯著下降，見圖1。

2.2 NR2F2蛋白在組織中的表達(dá)及與臨床病理因素的關(guān)系 鼻咽癌組織中NR2F2蛋白染色主要位于細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色，見圖2。在43例正常鼻咽黏膜及癌旁組織中有31例為明顯NR2F2蛋白染色，陽性表達(dá)率約為72%；而在124例鼻咽癌組織中則有39例為NR2F2蛋白染色陽性， 陽性表達(dá)率約為31%；正常及癌旁組織中的NR2F2蛋白陽性率明顯高于鼻咽癌組織（P<0.01），見表1。NR2F2蛋白表達(dá)水平與腫瘤的侵犯范圍（T）呈負(fù)相關(guān)（P<0.01），與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N）無關(guān)（P>0.05），見表2。

3結(jié)論

類固醇/甲狀腺激素核受體家族成員已經(jīng)在許多物種中被克隆并廣泛表達(dá)于各種組織[6]。在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化過程中有著重要的作用。人轉(zhuǎn)錄因子NR2F2，也稱為COUP-TFII，定位于15q26.2，包含414個氨基酸的蛋白質(zhì)，具有兩個典型的半胱氨酸類鋅指結(jié)構(gòu)作為DNA結(jié)合域。研究表明NR2F2在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌等幾種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[7- 8]，但具體過程仍不清楚。

我們通過實(shí)時定量rtPCR檢測三種鼻咽癌細(xì)胞株（CNE1、CNE2、58F）和鼻咽上皮細(xì)胞株（NP69）中NR2F2基因mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相對于NP69細(xì)胞株，CNE1、CNE2和58F細(xì)胞株中NR2F2基因mRNA表達(dá)顯著下降，提示NR2F2基因表達(dá)抑制可能與鼻咽癌發(fā)生有關(guān)。Krista等在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，并提出COUP-TF低表達(dá)可能促進(jìn)它莫西芬（TAM）（一種抗雌激素）抵抗及乳腺癌發(fā)生的假設(shè)，他們利用siRNA技術(shù)干擾COUP-TFII（即NR2F2）在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)COUP-TFII表達(dá)下降時會降低4-OHT 和ICI 182，780對乳腺癌細(xì)胞生長抑制的作用；相反，當(dāng)通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染提高COUP-TFII表達(dá)則可抑制TAM抵抗性乳腺癌細(xì)胞的增值[4]。這些結(jié)果都表明NR2F2表達(dá)抑制可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，NR2F2在31%（39/124）的鼻咽癌組織中有表達(dá)。在正常的鼻咽上皮組織及癌旁組織中，NR2F2蛋白為72%（31/43）的陽性表達(dá)率，表明相對于正常組織而言，NR2F2蛋白在鼻咽癌組織中表達(dá)受到抑制。這種差異表達(dá)提示NR2F2蛋白在鼻咽癌的發(fā)生中可能具有一定的作用。進(jìn)一步與臨床病理因素的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)NR2F2蛋白表達(dá)水平與腫瘤的侵犯范圍（T）呈負(fù)相關(guān)（P<0.01）。Lacey等利用乳腺癌組織芯片免疫組化分析發(fā)現(xiàn)在TNM分期中處于II期和II～I(xiàn)II期的乳腺癌組織COUP-TFII著色有顯著差異。332例乳腺癌樣本中約有47%的樣本細(xì)胞核中COUP-TFII呈陽性；COUP-TFII的表達(dá)與乳腺癌腫瘤分級顯著相關(guān)，高分級的樣本中COUP-TFII的表達(dá)趨向于陰 性[9]。由此可以推斷NR2F2的表達(dá)水平可以反映腫瘤細(xì)胞的增值程度與分化狀態(tài)。

綜上所述，本研究通過比較鼻咽癌細(xì)胞株和鼻咽上皮細(xì)胞株中NR2F2基因的mRNA表達(dá)水平的差異，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)在鼻咽癌細(xì)胞株中存在較為顯著的表達(dá)抑制。組織芯片免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)NR2F2蛋白在腫瘤組織中表達(dá)率顯著低于在正常組織和癌旁組織中的表達(dá)率且NR2F2蛋白表達(dá)水平與腫瘤的侵犯范圍（T）呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果表明NR2F2基因表達(dá)的抑制可能參與鼻咽癌的發(fā)生。

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編輯/張燕