摘要：目的與方法 制備整合VEGF和/或BMP基因的殼聚糖/膠原支架，觀察該組織工程支架的對(duì)人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞增殖、成骨向分化的影響，并比較整合不同生長(zhǎng)因子的組織工程支架在種植體周圍骨缺損模型中成骨的差異。結(jié)果 培養(yǎng)于整合有BMP腺病毒的支架上的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞ALP活性明顯高于其他組，MTT檢測(cè)支架對(duì)細(xì)胞增殖無影響。植入體內(nèi)種植體周圍缺損實(shí)驗(yàn)中，組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，整合了BMP-2腺病毒的支架的骨形成量均多于未整合BMP-2腺病毒的支架，并且同時(shí)整合VEGF蛋白和BMP- 2腺病毒的支架相結(jié)合的骨生成量最高。結(jié)論 整合病毒以及生長(zhǎng)因子蛋白的支架生物相容性好，不影響細(xì)胞在支架上的增殖。整合VEGF蛋白和BMP- 2基因的支架在促進(jìn)骨愈合中具有有協(xié)同效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF；BMP-2；骨再生

據(jù)估計(jì)，全世界每年有2.2 萬的骨科、神經(jīng)外科及口腔科患者因骨缺損行骨移植手術(shù)。目前常見的骨移植材料有自體骨、同種異體骨、脫礦化骨基質(zhì)、異種骨、合成材料、組織工程產(chǎn)品等。自從滅活骨、脫鈣骨能夠誘導(dǎo)異位骨再生的現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)以來，科學(xué)家們認(rèn)識(shí)到蛋白在誘導(dǎo)骨再生中起到關(guān)鍵作用，基于生物活性分子的骨組織工程成為研究的熱點(diǎn)。骨是高度血管化的組織，血管生成對(duì)骨再生至關(guān)重要。缺乏血管生成會(huì)導(dǎo)致骨再生中骨形成和骨總量減少。新生的血管對(duì)于營養(yǎng)供應(yīng)、分子信號(hào)的傳輸和干細(xì)胞的運(yùn)輸十分重要。血管生成對(duì)骨再生的意義重大，眾多學(xué)者嘗試?yán)么龠M(jìn)血管生成的因子與骨再生的因子結(jié)合共同促進(jìn)骨愈合。本研究試圖利用VEGF與BMP-2制備基因活化的仿生生物材料，觀察其對(duì)骨缺損的愈合中的促進(jìn)作用。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為5個(gè)組，包括：純殼聚糖/膠原支架，記為G1（group 1）；整合BMP-2腺病毒的殼聚糖/膠原支架，記為G2（group 2）；整合VEGF腺病毒的殼聚糖/膠原支架，記為G3（group 3）；整合BMP-2腺病毒和VEGF腺病毒的殼聚糖/膠原支架，記為G4（group 4）；以及整合BMP-2腺病毒和VEGF蛋白的殼聚糖/膠原支架，記為G5（group 5）。

1.2殼聚糖膠原支架的制備及復(fù)合病毒 將殼聚糖用0.5mol/L乙酸配成2%（w/v）的溶液，將膠原按2%比例溶解于殼聚糖溶液中，磁力攪拌48h后注入培養(yǎng)皿，4℃ 下放置30min，-35℃放置過夜，最后-80℃放置2h成型后移入冷凍干燥機(jī)凍干，48h后干燥完成。支架在接種細(xì)胞或病毒前需滅菌，具體步驟如下：先以0.3M NaOH的溶液中和材料中的乙酸，然后75%乙醇浸泡12h，大量PBS沖洗去除殘余乙醇，紫外線照射30min。

將殼聚糖/膠原支架切塊。在無菌操作臺(tái)內(nèi)，將病毒液滴于支架上，使之浸潤，具體量為：對(duì)于G2，G3組，1ml 的腺病毒溶液滴到1mg 的干燥的殼聚糖/膠原支架上，4℃ 過夜使支架與質(zhì)?；蛳俨《境浞纸Y(jié)合，然后-80℃放置2h成型后移入冷凍干燥機(jī)干燥。對(duì)于G4組， Ad-BMP-2與Ad-VEGF病毒液等體積混合后，吸取1ml滴到1mg殼聚糖/膠原支架上，4℃ 過夜使支架與質(zhì)?；蛳俨《境浞纸Y(jié)合，然后-80℃放置2h成型后移入冷凍干燥機(jī)干燥。對(duì)于G5組，將2mg VEGF-D蛋白溶解于2ml的滅菌的去離子水中，獲得的終濃度為濃度為1mg/ml，將2ml溶液滴于干燥的殼聚糖/膠原支架上，再將1ml 的Ad-BMP-2病毒溶液滴到1mg 的干燥的殼聚糖/膠原支架上，所獲得的支架為每1mg 支架有2mg VEGF蛋白及1mlAd-BMP-2病毒液；4℃ 過夜使支架與質(zhì)?；蛳俨《境浞纸Y(jié)合，然后-80℃放置2h成型后移入冷凍干燥機(jī)干燥（圖1示冷凍干燥機(jī)及干燥過程）。

1.3整合不同生長(zhǎng)因子的支架對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞增殖分化影響的相關(guān)研究 MTT 法檢測(cè)支架材料對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。將五種支架各選4 塊置于24孔板內(nèi)，第四代骨髓間充質(zhì)細(xì)胞消化后，以1×105 細(xì)胞的密度接種于支架，每個(gè)支架100μl細(xì)胞懸液。3h后添加 150μl 10%FBS 的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在1、3、7d 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。

ALP檢測(cè)：接種方法同前，3 h后添加 900μl 10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在7d和14d 檢測(cè)ALP活性。具體方法如下：7和14d后，取上清液，80μl的上清加20μl的0.5M的AMP，然后加入100μl底物，混勻后37°孵育1h。取50μl上清，按堿性磷酸酶試劑盒說明書在405nm波長(zhǎng)下測(cè)ALP活性。根據(jù)換算出的每孔細(xì)胞的ALP值和DNA的總量的比值來計(jì)算每孔細(xì)胞的ALP活性，單位是nmoles paranitrophenol/ng DNA/min。

1.4骨缺損修復(fù)的觀察 選取 6 只2歲大的中華田園犬，手術(shù)在全麻下進(jìn)行。局部消毒后，拔除下頜前磨牙，清理牙槽窩后，去除牙槽間隔，以得到骨缺損模型。植入種植體，將支架放入近中牙槽窩，縫合。將G1-G5組每組中的一個(gè)樣本隨機(jī)置于種植體近中缺損區(qū)，以保證每只狗都含有5個(gè)組的樣本。術(shù)后肌肉注射抗生素（40萬單位/ml，0.1ml/kg體重），動(dòng)物軟食2w。12w時(shí)取材，截取下頜骨種植體周圍缺損區(qū)骨，低速渦輪機(jī)及去離子水沖洗冷卻下分割標(biāo)本，進(jìn)行組織學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1 材料制備。

2.2通過MTT法檢測(cè)支架材料對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。第四代骨髓間充質(zhì)細(xì)胞三維培養(yǎng)于支架材料中后，分別在1、3、7d檢測(cè)，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)四個(gè)樣品。結(jié)果顯示（圖2），復(fù)合病毒或/和生長(zhǎng)因子蛋白的殼聚糖/膠原支架與殼聚糖/膠原材料對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的增殖沒有影響，病毒或/和生長(zhǎng)因子蛋白對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的增殖無毒性作用。

2.3 ALP活性是細(xì)胞成骨向分化的標(biāo)記。骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在各組復(fù)合支架上三維培養(yǎng)時(shí)的ALP活性如圖3所示，7d和14d培養(yǎng)后，培養(yǎng)于復(fù)合Ad-BMP-2的支架上的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞均表現(xiàn)出較高的ALP活性（P<0.05）， VEGF不能誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞成骨向分化。

2.4組織學(xué)染色 組織學(xué)切片觀察種植體周圍的組織形態(tài)，圖4可見，種植體周圍均形生成了成熟的骨組織，骨組織中均有新生成的血管。定性觀察發(fā)現(xiàn)，G3與G4組新生成的血管較其他組高，G2，G4及G5組的骨生成多于G1，G3組，以G5組最高。

3 討論

骨缺損修復(fù)是復(fù)雜的生理過程，一般涉及到細(xì)胞遷移、增殖與分化以及骨重建[1]。通常骨形成可通過兩種不同的方式：假如骨斷端是固定的，或者在發(fā)育階段顱面部骨形成過程中，在將要形成骨的部位間充質(zhì)前體細(xì)胞直接分化為骨細(xì)胞成骨，成為膜內(nèi)成骨；若發(fā)生在有動(dòng)度骨折斷端間，或者發(fā)育過程中的長(zhǎng)骨和腰椎，則先形成軟骨稱之為軟骨化骨。新生血管提供營養(yǎng)和氧氣的供應(yīng)，同時(shí)為血液循環(huán)中的間充質(zhì)細(xì)胞提供途徑到達(dá)缺損區(qū)，以及增加骨細(xì)胞的增殖分化而起作用，在骨折愈合的初期十分重要 [2]。VEGF是主要的血管生成因子[3]。它在出生后的血管生成起到重要的作用。VEGF對(duì)肥厚性軟骨結(jié)構(gòu)和血管化都十分重要。眾多研究發(fā)現(xiàn)，VEGF 單獨(dú)不能促進(jìn)成骨[4，5]，已有研究證實(shí)VEGF與BMPs聯(lián)合使用能促進(jìn)細(xì)胞存活率[6]，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖與分化[7]，以及促進(jìn)骨細(xì)胞遷移[8]，通過這種方式促進(jìn)了骨的再生。眾多學(xué)者在動(dòng)物模型中聯(lián)合應(yīng)用VEGF 與BMP-2促進(jìn)骨再生，總的來說，大多數(shù)因子的聯(lián)合使用較單獨(dú)使用能增加成骨，單獨(dú)使用VEGF 不足以促進(jìn)成骨，聯(lián)合使用VEGF能促進(jìn)骨再生中的血管再生，這與本研究結(jié)果一致。有研究指出，在骨折愈合中，血管發(fā)生發(fā)生在成骨之前[9]。因此，開發(fā)一種模擬內(nèi)源性基因釋放的這種呈時(shí)間特異性表達(dá)的基因控釋系統(tǒng)對(duì)骨組織工程意義十分重大。

由于VEGF在骨再生中有多種作用， VEGF除了促進(jìn)成骨細(xì)胞的存活，它還能誘導(dǎo)血管再生。VEGF刺激內(nèi)皮的增殖與遷移，并參與祖細(xì)胞的招募及分化為內(nèi)皮細(xì)胞[10，11]。高劑量的VEGF已被證實(shí)能導(dǎo)致血管通透性的增加，并在骨再生中誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的非生理性的內(nèi)皮細(xì)胞管腔[12]。

研究者已經(jīng)成功復(fù)合了殼聚糖/膠原支架。對(duì)于復(fù)合支架來說，殼聚糖的加入能降低細(xì)胞介導(dǎo)的收縮率，即在培養(yǎng)細(xì)胞的過程中，復(fù)合材料的收縮度比單純膠原支架的收縮率小，材料的機(jī)械性能有所增強(qiáng)。細(xì)胞在復(fù)合支架中更容易黏附，生長(zhǎng)并增殖。分析是因?yàn)槟z原成分的加入在四個(gè)方面提高了材料的細(xì)胞相容性：其一，降低了復(fù)合材料的孔徑，增大了材料的細(xì)胞容積；其二，增大了復(fù)合材料的吸水性，使細(xì)胞在支架中更容易交換營養(yǎng)與代謝物；其三，膠原本身可作為細(xì)胞營養(yǎng)的來源；其四，降低了材料的降解性能，使細(xì)胞更容易滲透到支架內(nèi)部生長(zhǎng)繼而引發(fā)進(jìn)一步的支架降解?？偟膩碚f，本實(shí)驗(yàn)制備了一種基因控釋支架，通過冷凍干燥法使生長(zhǎng)因子與腺病毒結(jié)合，腺病毒介導(dǎo)的外源性基因能高效表達(dá)，在缺損區(qū)局部釋放，避免了腺病毒導(dǎo)致的免疫反應(yīng)，在骨再生中具有潛在的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]Carano RA， Filvaroff EH. Angiogenesis and bone repair. Drug Discov Today 2003；8：980-9. [2]Asahara T， Takahashi T， Masuda H， et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells[J]. EMBO J，1999，18：3964-3972.

[3]Peng H， Wright V， Usas A， et al. Synergistic enhancement of bone formation and healing by stem cell-expressed VEGF and bone morphogenetic protein-4[J]. J Clin Invest，2002，110：751-759.

[4]Peng H， Usas A， Olshanski A， et al. VEGF improves， whereas sFlt1 inhibits， BMP2-induced bone formation and bone healing through modulation of angiogenesis[J]. J Bone Miner Res， 2005，20（11）：2017-2027.

[5]Samee M， Kasugai S， Kondo H，et al. Bone morphogenetic protein-2 （BMP-2） and vascular endothelial growth factor （VEGF） transfection to human periosteal cells enhances osteoblast differentiation and bone formation[J]. J Pharmacol Sci，2008，108：18-31.

[6]Byrne AM， Bouchier-Hayes DJ， Harmey JH. Angiogenic and cell survival functions of vascular endothelial growth factor （VEGF）[J]. J Cell Mol Med，2005，9：777-94.

[7]Wang， D.S.， Miura， M.， Demura， H. Sato， K. Anabolic effects of 1，25-dihydroxyvitamin d3 on osteoblasts are enhanced by vascular endothelial growth factor produced by osteoblasts and by growth factors produced by endothelial cells[J]. Endocrinology，1997，138： 2953-2962.

[8]Mayr-Wohlfart U， Waltenberger J， Hausser H， et al. Vascular endothelial growth factor stimulates chemotactic migration of primary human osteoblasts[J]. Bone，2002，30：472-477.

[9]Sojo K， Sawaki Y， Hattori H， et al. Immunohistochemical study of vascular endothelial growth factor （VEGF） and bone morphogenetic protein-2， -4 （BMP-2， -4） on lengthened rat femurs[J]. J Craniomaxillofac Surg，2005，33：238-245.

[10]Winet， H. The role of microvasculature in normal and perturbed bone healing as revealed by intravital microscopy[J]. Bone，1996，19： 39S-57S.

[11]Ribatti D. The crucial role of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor in angiogenesis： a historical review[J]. Br J Haematol，2005，128：303-209.

[12]Shen YH， Shoichet MS， Radisic M. Vascular endothelial growth factor immobilized in collagen scaffold promotes penetration and proliferation of endothelial cells[J]. Acta Biomater ，2008，4：477-489.

編輯/哈濤