摘要：目的 探討oxHDL3對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC-12細(xì)胞組織型纖溶酶原激活物（tissue type plasminogen activator，t-PA）表達的影響。方法 HUVEC-12細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度（0、20、40、80 mg/L）HDL3、oxHDL3孵育，采用RT-PCR的方法檢測t-PAmRNA表達情況。結(jié)果 與0mg/L oxHDL3組比較，oxHDL3呈劑量依賴性下調(diào)t-PA mRNA的表達，以80 mg/L oxHDL3濃度組減少最明顯，較0mg/LoxHDL3組下降了30%（P<0.05）。結(jié)論 oxHDL3呈劑量依賴性下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞t-PA mRNA的表達。

關(guān)鍵詞：t-PA；HDL3；oxHDL3；動脈粥樣硬化

中圖分類號：R183.4 文獻標(biāo)志碼：A

動脈粥樣硬化病變發(fā)生的原因和發(fā)病機制一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的重要研究課題。已有的證據(jù)表明，動脈粥樣硬化與脂蛋白代謝密切相關(guān)。Nakajima等在人腹主動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膜處用oxHDL 特異抗體9F5-3a檢測到oxHDL的存在，并定位在主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，清道夫受體SR-B1 和 LOX-1是其受體[1]。最近有文獻證實，oxHDL及亞型oxHDL2、oxHDL3通過激活p38MAPK上調(diào)TF的表達[2]，此外，oxHDL及其亞型還可通過減少內(nèi)皮細(xì)胞TFPI-1分泌[3]，減弱對TF的抑制作用，干擾體內(nèi)抗凝/促凝平衡，從而促進As血栓的形成。這提示oxHDL在As發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本文通過觀察oxHDL3對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC-12細(xì)胞表達t-PA mRNA的影響，為闡明oxHDL在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供新的實驗依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料 HUVEC-12細(xì)胞株來源于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品；谷氨酰胺、丙酮酸鈉、胰蛋白酶和EDTA為Sigma產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季清產(chǎn)品。通用RT-PCR試劑盒購自北京博大泰克生物公司。健康人血漿購自衡陽市血站。

1.2方法

1.2.1 HDL3和oxHDL3的制備和鑒定 HDL3的制備：采用密度梯度超速離心的方法分離健康人血漿中的HDL（1.063～1.21 g/mL）、HDL2（1.063～1.125 g/mL）、HDL3（1.125～1.21 g/mL）；oxHDL3的制備：HDL3于4℃用PBS透析24 h后。1 mg/mL HDL3在37℃與含20 μmol/L CuSO4的PBS溶液孵育24 h。4℃，用含0.1% EDTA的PBS透析24 h，換液1次/8 h。BCA法蛋白定量，過濾除菌，4℃避光保存。HDL3和oxHDL3的鑒定：將HDL3和oxHDL3分別進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，oxHDL3電泳遷移率明顯快于HDL3表明已經(jīng)被氧化修飾。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC-12貼壁生長于10%小牛血清RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中含1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺、100 IU青霉素和鏈霉素，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每次實驗前24 h換新鮮培養(yǎng)基后加處理因素。

1.2.3細(xì)胞總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 收集細(xì)胞，總RNA提取試劑提取總RNA。根據(jù)之前研究[3]，t-PA引物序列上游：5-GAGCCAAGGTGTTTCAACG-3，下游5-CCCATTCCCAAAGTAGCAG-3，PCR擴增產(chǎn)物長度399 bp；內(nèi)參照采用GAPGH，引物序列上游5-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3，下游5-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3，PCR擴增長度為697 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃下5 min預(yù)變性，94℃下30 s變性，58℃下30 s退火，72℃下45 s延伸，35個循環(huán)，72℃ 10 min繼續(xù)延伸。反應(yīng)結(jié)束后，取RT-PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳中電泳。

1.2.4統(tǒng)計學(xué)處理 實驗所得數(shù)據(jù)均為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），組間采用方差分析及t檢驗，由SPSS 11.0統(tǒng)計軟件完成，P<0.05為差異具有顯著性。

2結(jié)果

2.1 HDL3氧化修飾前后鑒定 瓊脂糖凝膠電泳顯示，見圖1，HDL3成一條帶。經(jīng)20 μmol/L CuSO4孵育20 h后，由于陰離子含量增多，oxHDL3電泳遷移率明顯快于天然的HDL3，表明已被氧化修飾。

2.2 oxHDL3對HUVEC-12細(xì)胞t-PAmRNA表達的影響 分別用不同濃度的HDL3、oxHDL3（0 mg/L，20 mg/L，40 mg/L，80 mg/L）孵育HUVEC-12 24 h后，用RT-PCR方法檢測各組t-PA mRNA 的水平，見圖2。結(jié)果顯示，與0 mg/L oxHDL3組相比，20 mg/L、40 mg/L，80 mg/L oxHDL3濃度組細(xì)胞t-PAmRNA的表達均有所減少，以80 mg/L濃度組減少最明顯，較0 mg/L oxHDL3組下降了30%（P<0.05）。不同濃度的HDL3對HUVEC-12細(xì)胞t-PA mRNA表達的影響不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明oxHDL3可下調(diào)HUVEC-12 細(xì)胞t-PAmRNA的表達。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)HDL氧化修飾后在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，oxHDL2，oxHDL3這兩種亞型在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中的作用有所差異。值得注意的是本研究發(fā)現(xiàn)oxHDL3顯著下調(diào)HUVEC-12細(xì)胞t-PA的表達。這表明，oxHDL3在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮了更為重要的作用。最近有文獻報道[4]，小而密HDL具有較強的抗氧化活性和抗炎作用，而小而密HDL主要為HDL3，提示此種類型的HDL的修飾改變將導(dǎo)致更嚴(yán)重的后果。這也進一步證明了oxHDL3的致動脈粥樣硬化病理效應(yīng)可能強于其他類型的氧化HDL。因此，進一步闡明oxHDL3參與動脈粥樣硬化形成的病理生理作用和機制，為預(yù)防和控制動脈粥樣硬化性疾病提供幫助顯得尤為重要。

參考文獻：

[1]Nakajima T， Matsunaga T， Kawai S， Hokari S， Inoue I， Katayama S， Nagata A， Komoda T. Characterization of the epitopes specific for the monoclonal antibody 9F5-3a and quantification of oxidized HDL in human plasma[J].Ann Clin Biochem， 2004，41（4）：309-315.

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編輯/張燕