摘要：目的 探討丙泊酚對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)凋亡神經(jīng)元線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和細(xì)胞色素C（CytC）的影響。方法 36只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組和丙泊酚組（n=12），復(fù)制大鼠全腦缺血再灌注模型，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠腦海馬區(qū)CytC表達(dá)；采用比色法測(cè)定大鼠腦海馬區(qū)凋亡神經(jīng)元線粒體ATPase的改變。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組和丙泊酚組CytC的表達(dá)均增加（P<0.05），ATP酶的活性均降低（P<0.05）；丙泊酚組大鼠腦組織海馬區(qū)CytC的表達(dá)低于模型組（P <0.05），ATP酶的活性高于模型組（P <0.05）。結(jié)論 丙泊酚的神經(jīng)保護(hù)與改善腦缺血損傷后海馬區(qū)凋亡神經(jīng)元CytC的釋放和ATPase的活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：丙泊酚；腦缺血；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞色素C；ATP酶

腦缺血再灌注損傷-凋亡反應(yīng)機(jī)制在損傷中的作用日益受到關(guān)注[1]。丙泊酚為臨床常用靜脈麻醉藥，研究證實(shí)丙泊酚具有神經(jīng)保護(hù)作用[2，3]，但在線粒體水平的作用機(jī)制研究報(bào)道較少。本研究擬觀察觀察丙泊酚對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡神經(jīng)元線粒體CytC及ATPase的影響，進(jìn)一步探討丙泊酚對(duì)腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康雄性清潔級(jí)SD大鼠 36只，體重250～300g，由濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組和丙泊酚組（n=12）。

1.2動(dòng)物模型制備 大鼠術(shù)前16h禁食。 腹腔注射 3%戊巴比妥鈉45mg·kg-1麻醉后，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，然后用無損傷微動(dòng)脈夾同時(shí)阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流造成腦缺血，檢查遠(yuǎn)端血流情況以確保完全阻斷血流。腦缺血時(shí)間為10 min，松開動(dòng)脈夾恢復(fù)腦血流即為再灌注。丙泊酚組在再灌注即刻經(jīng)舌靜脈泵注丙泊酚 20 mg·kg-1·h-1，模型組給予等量生理鹽水代替，持續(xù)2 h。再灌注 2 h后處死大鼠取海馬。

1.3 CytC和ATPase的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CytC（美國(guó)RD Rat Cytochrome-C Elisa測(cè)定試劑盒）；應(yīng)用比色法測(cè)定Na+-K+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase（南京建成生物工程研究所ATP酶試劑盒）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用x±s表示，采用方差分析t檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組和丙泊酚組CytC的表達(dá)均增加（P<0.05），Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+ATP酶的活性均降低（P<0.05）；丙泊酚組大鼠腦組織海馬區(qū)CytC的表達(dá)低于模型組（P<0.05），Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+ATP酶的活性。

注：與假手術(shù)組比較，* P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

3 討論

缺血后神經(jīng)元可有凋亡和壞死兩種形式，其共同的機(jī)制在于各種因素引起的線粒體功能的變化，這些因素包括ATP耗竭、CytC表達(dá)的改變等[4]。CytC是線粒體外膜腔隙的一種水溶性蛋白質(zhì)，在線粒體呼吸鏈中起電子傳遞作用[5]，諸多研究表明CytC與病理狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程有著密切的聯(lián)系[6]，CytC在缺氧條件下從線粒體中釋放到胞漿通過激活半胱天冬酶而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[7]。細(xì)胞凋亡時(shí)，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生重大變化，包括呼吸鏈電子傳遞的中斷、能量合成受阻、線粒體膜電位下降，并釋放促凋亡因子[8]，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。其中CytC是線粒體釋放的最重要的促凋亡因子之一。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶是廣泛分布在機(jī)體內(nèi)的生物膜酶系統(tǒng)，它們對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能起著極其重要的作用。繼發(fā)性腦缺血、缺氧可造成Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的降低[9]，在這些因素的作用下，線粒體及細(xì)胞發(fā)生一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)和變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)神經(jīng)元線粒體CytC的表達(dá)增加，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低，說明海馬區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)線粒體凋亡。丙泊酚進(jìn)行干預(yù)可減輕腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)神經(jīng)元CytC的釋放，CytC的表達(dá)明顯減少；并且在大鼠腦缺血再灌注損傷后線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性雖仍高于假手術(shù)組，但較模型組明顯降低，說明丙泊酚可提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，可減輕神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

總之，丙泊酚對(duì)腦缺血損傷的神經(jīng)元保護(hù)與改善海馬區(qū)凋亡神經(jīng)元CytC的釋放和Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性有關(guān)，在線粒體水平上進(jìn)一步探討了丙泊酚的腦保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cheng YY，Ni GX. An overview of apoptosis passageway after cerebral ischemia and its regulation of acupuncture[J]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2014，34（4）：499-502.

[2]Zhao XC，Zhang LM，Tong DY， et al. Propofol increases expression of basic fibroblast growth factor after transient cerebral ischemia in rats[J]. Neurochem Res，2013，38（3）：530-537.

[3]Zhang H， Mei X， Wang W， et al. Blocking conversion of GABAergic inhibition as a potential mechanism of propofol-mediated brain protection following resuscitation[J]. 2009，22（9）：525-529.

[4] NeumarR. Molecular mechanisms of ischemie neuronal injury[J].Ann Emerg Med，2000，36 （5）：483-506.

[5] Gorini A，Canosi U，Devecchi E，et al. ATPases enzyme activities during ageing in different types of somatic and synaptic plasma membranes from rat frontal cerebral cortex[J]. Progress in Neuro-Psychopharmacology Biological Psychiatry，2002，26（1）：81-90.

[6] Green DR， Reed JC. Mitochondria and apoptosis[J].Science， 1998，281（5381）：1309-12.

[7] Hirai K， Sugawara T， Chan PH， et al. Cytochrome c associated apoptosis during ATP recovery after hypoxia in neonatal rat cerebrocortical slices[J]. J Neurochem，2002，83（2）：309-319.

[8] Chen L， Xue Z， Jiang H. Effect of propofol on pathologic time-course and apoptosis after

cerebral ischemia-reperfusion injury[J].Acta Anaesthesiology Scand，2008， 52 （3）： 413-419.

[9] Xing B， Chen H， Zhang M， et al. Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in the rat[J]. Stroke，2008， 39（8）： 2362-2369.

編輯/王海靜