摘要：目的 本研究擬通過RNA干擾技術(shù)抑制CXCR4基因的表達，并觀察其對淋巴瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。方法 設計合成CXCR4 特異性小干擾RNA（siRNA），并轉(zhuǎn)染JURKAT細胞。通過qPCR檢測CXCR4 mRNA 的表達，用Transwell小室體外細胞侵襲模型檢測細胞體外侵襲能力。結(jié)果 轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4-siRNA的JURKAT細胞CXCR4基因表達明顯受抑制；與對照組比較，其細胞侵襲能力亦明顯降低。結(jié)論 應用RNA干擾靶向沉默技術(shù)，高效特異性地抑制淋巴瘤細胞CXCR4 基因的表達，從而抑制腫瘤的侵襲能力。

關鍵詞：惡性淋巴瘤；siRNA ；CXCR4

惡性淋巴瘤是一組原發(fā)于淋巴結(jié)和（或）結(jié)外部位淋巴組織的淋巴細胞或組織細胞的惡性腫瘤。本研究擬通過RNA干擾技術(shù)，靶向沉默CXCR4基因的表達，觀察其對淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響。

1材料與方法

1.1材料與試劑 人淋巴瘤細胞株JURKAT由南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院血液病實驗室惠贈；pRNAT-U6.2/Lenti購于GenScript公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購于QIAGEN公司。

1.2細胞培養(yǎng) JURKAT細胞用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液傳代。

1.3質(zhì)粒載體的構(gòu)建 利用Takara、AMbion和Promega siRNA靶序列分析設計系統(tǒng)，掃描人CXCR4 cDNA編碼序列，依據(jù)siRNA靶序列設計原則，經(jīng)BLAST同源性分析。設計包含XholⅠ和BamHⅠ酶切殘端的1對靶向CXCR4發(fā)卡樣DNA寡核苷酸，由上海生工公司分別合成2對編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，其序列如下：5'-GATCC GGAACCCTGTTTCCGTGAATTCAAGAGA TTCACGGAAACAGGGTTCC TTTTTTC-3' （sense） and 5'-TCGAG AAAAAA GGAACCCTGTTTCCGTGAA TCTCTTGAA TTCACGGAAACAGGGTTCC G-3' （antisense）。 選取其中一個序列打亂并無基因同源性作為陰性對照序列（NC）。其寡核苷酸序列：5'-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3' （sense） and 5'-ACGTGACACGTTCGGAGAAT-3' （antisense），用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切空質(zhì)粒pRNAT-U6.2/Lenti，將退火形成的雙鏈定向克隆至該真核載體上，經(jīng)篩選后，再進行測序鑒定。

1.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定篩選 參照Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，通過脂質(zhì)體將表達載體（pRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4-SiRNA）和空質(zhì)粒（pRNAT-U6.2/Lenti）轉(zhuǎn)染入JURKAT細胞，經(jīng)G418篩選建立穩(wěn)定傳代的細胞系。

1.5熒光定量PCR檢測CXCR4 mRNA表達 采用Trizol法提取細胞總RNA，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄，得到總cDNA。分別擴增目的基因CXCR4及內(nèi)參對照 -actin，引物序列如下：CXCR4上游引物5'- CAATGACTTGTGGGTGGTTGTG-3'，下游引物5'- ATGCAATAGCAGGACAGGATGA -3'； -actin上游引物5′- TGGCACCCAGCACAATGAA -3′，下游引物5′- CTAAGTCATAGTCCGCCTAG

AAGCA -3′。擴增條件：95℃預變性30s，95℃變性3s，60℃退火和延伸30s，循環(huán)40次。記錄各管擴增CT值，換算出基因拷貝數(shù)。以CXCR4基因拷貝數(shù)與 -actin基因拷貝數(shù)的比值作為CXCR4相對表達水平。

1.6 Transwell小室侵襲實驗 以預冷的RPMI1640與Matrigel膠1：1稀釋后，取100μl稀釋膠加到Transwell上層小室中，于37℃孵育6h。收集各組細胞，消化成單細胞懸液，用含1%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，按5×104/ml個細胞的密度將100μl接種于Transwell上層小室。吸取含10%胎牛血清或10%胎牛血清+100ng/ml SDF-1的RPMI1640培養(yǎng)基500μl加入Transwell下層小室，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。用棉簽沾PBS輕輕地擦去小室上層聚碳酸酯膜上貼壁生長但未能穿過膜的細胞。將膜取出放入預先裝有95%乙醇的24孔板內(nèi)固定10min。吸棄乙醇，加0.1%的結(jié)晶紫染色30min，用PBS小心洗去多余的染料，翻轉(zhuǎn)聚碳酸酯膜，小心撕下，晾干，置載玻片上加中性樹膠蓋玻片封片。在200倍放大倍數(shù)下隨機觀察并計10個視野內(nèi)穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)，照相記錄。重復3次。

1.7統(tǒng)計學方法 SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學處理，各組間比較應用單因素方差分析，檢驗標準以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 JURKAT細胞CXCR4 mRNA的表達 轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4-SiRNA的JURKAT細胞中CXCR4 mRNA表達水平均明顯降低，與空載體組和空白組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。而空載體組和空白組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

2.2各組JURKAT 細胞體外侵襲能力 空白對照、陰性對照、siRNA 轉(zhuǎn)染組JURKAT細胞的穿膜細胞數(shù)分別為（109.30±8.03）、（107.80±9.51）、（54.60±10.06） ，3者比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=126.356，P<0.001）。siRNA 轉(zhuǎn)染組JURKAT細胞的穿膜細胞數(shù)明顯低于空白對照和陰性對照組（P<0.05）。

圖1 CXCR4靶向沉默對淋巴瘤細胞JURKAT侵襲能力的抑制作用

3討論

基質(zhì)細胞衍生因子-1 （ SDF-1）是趨化因子CXC亞家族的重要成員之一，又名CXCL12，它與其特異性的G蛋白偶聯(lián)受體CXCR4 具有高度的親和性?，F(xiàn)有的研究表明， SDF-1與CXCR4所構(gòu)成的受配體系統(tǒng)不僅在細胞的炎癥反應、造血干細胞的遷移與歸巢等生物學過程中發(fā)揮著重要的作用，而且還可能在腫瘤尤其是血液腫瘤的發(fā)生以及浸潤等環(huán)節(jié)起著一定的作用[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個具有高度組織性和器官選擇性的復雜連續(xù)過程。雖然已證明很多因素參與腫瘤的轉(zhuǎn)移，但是，不同組織來源的腫瘤細胞遷移、侵襲到特定部位的分子機制還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4在惡性淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、鼻咽癌、肺癌、卵巢癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤細胞中的表達增高，CXCR4與其配體SDF-1的相互作用可能在其侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，因此推斷抑制腫瘤細胞表面CXCR4 的表達，干擾SDF-1/CXCR4 的相互作用可能是抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個比較有意義的靶點和策略。

siRNA可以特異性地剔除或關閉特定基因的表達，被廣泛應用于基因功能探索和惡性腫瘤的基因治療。國外學者用siRNA封閉CXCR4基因后使乳腺癌細胞的侵襲和粘附能力明顯下降，將封閉CXCR4基因后的乳腺癌細胞種植入SCID小鼠中可阻止腫瘤的發(fā)生，從而說明CXCR4可能控制乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移的潛在靶點。

淋巴瘤臨床分期是依據(jù)腫瘤對淋巴結(jié)區(qū)和（ 或） 結(jié)外器官侵犯范圍和程度不同來劃分，而臨床分期和結(jié)外器官受侵的數(shù)目與患者的預后明顯相關。Trentin 等[2]對21 例非霍奇金淋巴瘤（NHL） 患者研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4 是唯一在所有患者惡性B細胞均有表達的趨化因子， 并且SDF-1 對此類細胞有趨化作用。用CXCR4 抗體或SDF-1 抗體可抑制NHL 細胞的跨內(nèi)皮細胞和跨基質(zhì)細胞遷移，并且抑制其增殖和促進其凋亡[3]。動物實驗則發(fā)現(xiàn)NOD/SCID小鼠注射Namalwa 細胞后，全部在36d前死于造血異常，此類小鼠若在第3，10，17d 注射100 μg 的抗CXCR4，則7/12的腫瘤可完全去除，5/12腫瘤負荷明顯降低，并且未觀察到毒性作用。若由此證實，抗CXCR4可抑制NHL細胞的跨血管遷移作用，影響其向骨髓遷移，并且促進NHL細胞凋亡、降低腫瘤負荷，提示CXCR4 抗體及干擾CXCR4 作用的分子在NHL治療中有一定的臨床意義。我們的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4-SiRNA的JURKAT細胞CXCR4基因表達明顯受抑制；與對照組比較，其細胞侵襲能力亦明顯降低。

總之，我們應用RNA干擾靶向沉默技術(shù)，高效特異性地抑制淋巴瘤細胞CXCR4 基因的表達，從而抑制腫瘤的侵襲能力。由此可見CXCR4在惡性淋巴瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機制中扮演重要角色，而靶向CXCR4基因治療則顯示出潛在的療效和前景。

參考文獻：

[1]Muller A， Homey B， Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J].Nature，2001，410：50-56.

[2]Trentin L， Cabrelle A， Facco M， et al . Homeostatic chemokines drive migration of malignant B cells in patients with non2Hodgkin lymphomas[J].Blood，2004，104 （2）：502-508.

[3]Bertolini F， Dell'Agnola C， Mancuso P， et al. CXCR4 Neutralization ， a novel therapeutic approach for non-hodgkin's lymphoma[J].Cancer Res，2002，62（11）：3106-3112.

[4]Reynolds A， Leake D， Boese Q， et al. Rational siRNA design for RNA interference [J]. Nat Biotechnol， 2004， 22（3）： 326-330.

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編輯/申磊