摘要：目的 通過觀察重組人促卵泡激素對正常大鼠超排卵作用及對不排卵模型大鼠的排卵影響，研究rhFSH對大鼠的藥效學(xué)作用。方法 ①超排卵實(shí)驗，正常雌性大鼠發(fā)情后期開始皮下注射rhFSH，給藥劑量15IU/kg/d，連續(xù)3d，發(fā)情前期給HCG10IU/只；②受孕實(shí)驗，給藥同上，發(fā)情前期給予HCG后將雌性大鼠與雄性大鼠合籠；③無排卵模型實(shí)驗，幼年雌性SD大鼠注射外源雄激素制造不排卵模型，用rhFSH治療15d。結(jié)果 rhFSH對正常大鼠的血清促性腺激素水平?jīng)]有明顯的抑制，rhFSH明顯增加正常大鼠的黃體數(shù)和卵泡數(shù)目和受孕大鼠的胎鼠數(shù)（與正常組相比，P<0.05）；可以改善無排卵模型大鼠的血清性激素水平，增加黃體數(shù)目和成熟卵泡（與模型組相比，P<0.05）。結(jié)論 rhFSH對正常大鼠超排卵和無排卵大鼠卵泡發(fā)育有較好的促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：排卵；大鼠；藥效學(xué)

重組人促卵泡激素（Recombinant human follicle-stimulating hormone， rhFSH）是將帶有重組后人促卵泡激素（hFSH）基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO），經(jīng)過培養(yǎng)表達(dá)生產(chǎn)的。它是目前人類輔助生殖技術(shù)中常用的藥物。由于糖基化作用的原因，原核表達(dá)系統(tǒng)難以生產(chǎn)出rhFSH。迄今為止，全球僅有兩家公司的rhFSH 藥物上市。對于動物的rhFSH藥效學(xué)研究沒有系統(tǒng)的報道，我們根據(jù)其臨床的主要適應(yīng)癥設(shè)計了三個實(shí)驗對其藥效學(xué)作用進(jìn)行系統(tǒng)的研究。對于超排卵作用方面，通過超排卵實(shí)驗和受孕實(shí)驗兩個實(shí)驗來進(jìn)行研究，對于無排卵作用方面，通過rhFSH對雄激素致無排卵大鼠模型的作用實(shí)驗來進(jìn)行研究。為重組人促卵泡激素的可靠藥效學(xué)評價建立基礎(chǔ)。

1材料與儀器

1.1實(shí)驗動物 雌性SD大鼠，體重200～250g；雄性SD大鼠，體重250～300g；9日齡雌性SD大鼠；均由中山大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK（粵）2011-0029。

1.2藥物與試劑 重組人促卵泡激素（rhFSH， Gonal-FR），生產(chǎn)廠家：默克雪蘭諾有限公司，批號A0002920；0.9% 氯化鈉注射液（NS），廣東艾希德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：121027207；HCG，杭州動物藥品廠， 批號12010；丙酸睪酮注射液，上海通用制藥有限公司，批號111104；甲醛，廣州化學(xué)試劑廠，生產(chǎn)批號：20120703，規(guī)格：AR，500ml/瓶；水合氯醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20120111，規(guī)格：250g/瓶；FSH、E2、LH、P、T激素檢測化學(xué)發(fā)光試劑盒均為雅培貿(mào)易（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.3主要儀器 光學(xué)顯微鏡成像系統(tǒng)：LEICA，DM5000B；全自動化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)，Abbott雅培公司，型號：ARCHITECT i2000 sr；電子天平：METTLER TOLEDO，SB32000。

2實(shí)驗方法

2.1促排卵實(shí)驗

2.1.1超排卵試驗 30只成年雌性SD大鼠按體重隨機(jī)分為空白對照組、rhFSH組每組15只，各組大鼠體重分布相似。通過陰道涂片法確定雌性大鼠的發(fā)情周期。發(fā)情周期為5d，分為發(fā)情間期（2d），發(fā)情前期，發(fā)情期和發(fā)情后期。從發(fā)情后期開始給藥，空白對照組皮下注射生理鹽水（NS）1ml/kg/d，給藥組皮下注射rhFSH 15IU/kg/d（根據(jù)臨床推薦劑體表面積折算成大鼠的劑量），1次/d，連續(xù)注射3d，第4d（發(fā)情前期）皮下注射HCG10IU/只（有類似黃體生成素的作用，與FSH合用，可誘發(fā)排卵），第5d（發(fā)情期）上午對大鼠進(jìn)行10%水合氯醛腹腔麻醉，腹腔靜脈取血3ml，用于檢測生化指標(biāo)。處死后摘除卵巢，稱重用Bouin氏液固定，常規(guī)脫水，包埋，石蠟切片，每隔6μm做連續(xù)切片，用于HE染色觀察卵巢組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)。

2.1.2受孕實(shí)驗 動物分組及給藥方法同\"2.1.1\"，并于第4d（發(fā)情前期）皮下注射HCG10IU/只后，將雌性大鼠與健康成年雄性大鼠1：1合籠，次日觀察交配數(shù)（以觀察到有精子或有陰道栓的為判斷標(biāo)準(zhǔn)），記錄交配數(shù)，已交配的繼續(xù)飼養(yǎng)12d后處死，分離子宮，記錄受孕數(shù)，計算受孕率；分離受孕大鼠子宮，記錄胚胎數(shù)，計算受孕胎鼠數(shù)。

2.2不排卵模型的治療作用

2.2.1造摸 參照魏美娟，俞瑾方法，9d齡，其中16只由頸背部一次性皮下注射中性茶油0.05ml為正常對照組；剩余35只由頸背部一次性皮下注射丙酸睪酮1.25mg/只，為造模動物組。第70d齡陰道開口，連續(xù)陰道涂片兩個動情周期。正常對照組動物連續(xù)陰道涂片應(yīng)呈現(xiàn)典型動情周期（動情前期、動情期、動情后期、動情間期），將動情周期不典型者剔除；而造模動物組動物的陰道上皮細(xì)胞應(yīng)無動情周期變化，呈持續(xù)性角化，提示無排卵大鼠模型制作成功，將未成功者剔除。經(jīng)過兩個動情周觀察正常對照組有1只動情周期不典型剔除，造模動物成功率90.8%。

2.2.2給藥 第81d齡后，正常對照組大鼠15只，按1ml/kg/d皮下注射給予蒸餾水，將成功無排卵大鼠模型動物，按體重隨機(jī)分為2組模型對照組16只、rhFSH組16只，模型對照組大鼠按1ml/kg/d皮下注射給予生理鹽水；rhFSH組大鼠按15IU/kg/d給予rhFSH。給藥結(jié)束后，各組大鼠均連續(xù)陰道涂片兩個動情周期，以判斷大鼠排卵情況。

2.2.3取材 各組大鼠于動情周期前期時。再取子宮、卵巢、腎上腺、垂體、組織稱重，子宮、卵巢、腎上腺計算臟器指數(shù)，并均選取左側(cè)的卵巢和子宮組織標(biāo)本置10%中性甲醛中固定，常規(guī)脫水，包埋，石蠟切片，每隔6μm做連續(xù)切片，用于HE染色觀察卵巢組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)。

3結(jié)果

3.1正常大鼠超排卵實(shí)驗結(jié)果

3.1.1血清性激素激素影響 結(jié)果由表1所示，rhFSH組與空白對照組相比，正常雌性大鼠發(fā)情期血清性激素（FSH、E2、P、LH）水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），提示在本研究劑量下rhFSH對正常大鼠發(fā)情期血清性激素水平?jīng)]有明顯的抑制作用。

3.1.2卵巢組織形態(tài)學(xué) 大體觀察可見兩組大鼠卵巢組織均色澤鮮紅邊緣光滑，卵泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)均較規(guī)則，與空白對照組相比，rhFSH組卵巢體積較空白對照組略大；光鏡下觀察rhFSH組卵泡顆粒細(xì)胞層數(shù)較空白對照組明顯增多；與空白對照組相比，rhFSH組大卵泡數(shù)目和小卵泡數(shù)目有顯著性增加差異（P<0.01），提示rhFSH對卵泡發(fā)育和超排卵有明顯促進(jìn)作用，見表2。

3.1.3受孕胎鼠數(shù)影響 大體觀察，兩組大鼠胚胎發(fā)育程度都較均勻；與空白對照組相比，rhFSH組可明顯增加雌性受孕大鼠胚胎數(shù)（P<0.01），交配率及受孕率未見顯著差異（P>0.05），提示rhFSH可明顯促進(jìn)卵泡的超排卵作用，見表3。

3.2 不排卵模型實(shí)驗結(jié)果

3.2.1血清性激素影響 與正常對照組比較，無排卵模型組大鼠各激素水平均顯著差異改變（P<0.01），F(xiàn)SH、E2、P、LH顯著降低，T顯著升高；與模型對照組比較，rhFSH組能顯著回升血清FSH、E2、P、LH，顯著降低血清T水平（P均<0.05或0.01），rhFSH對其它激素水平均有一定的改善作用，但未見統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。提示rhFSH對高雄激素導(dǎo)致的無排卵模型大鼠的生殖激素水平有一定的改善作用，見表4。

3.2.2 臟器指數(shù) 子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)、腎上腺指數(shù)、垂體重量變化，與正常對照組相比，模型對照組的子宮體指數(shù)和卵巢體指數(shù)顯著降低（P<0.01），腎上腺指數(shù)和垂體重量無顯著差異，與模型組相比rhFSH組子宮指數(shù)和卵巢體指數(shù)有增加的趨勢無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。腎上腺指數(shù)和垂體重量未見明顯差異（P>0.05），見表5。

3.2.3 卵巢病理形態(tài)學(xué) 大體觀察可見正常對照組卵巢體積較大色澤鮮紅，模型組卵巢萎縮色澤蒼白，rhFSH組卵巢體積較模型組大，可觀察到部分大鼠卵巢色澤呈粉紅色；光鏡下觀察正常組卵泡顆粒細(xì)胞排列整齊，層數(shù)較多有較多黃體組織，模型組卵泡顆粒細(xì)胞排列不規(guī)則，幾乎無黃體組織，rhFSH組卵泡顆粒細(xì)胞排列較整齊顆粒細(xì)胞層數(shù)較模型組增加，黃體組織較模型組增加；與正常對照組相比，模型組動物的次級卵泡、成熟卵泡和黃體數(shù)量明顯減少（P<0.05）；與模型組相比，rhFSH組動物次級卵泡、成熟卵泡和黃體數(shù)量相比模型對照組有明顯增加（P<0.05），提示：rhFSH對高雄激素致無排卵大鼠有一定的治療作用，見表6。

4討論

促性腺激素（gonadotropin，Gn） 藥物促排卵在不孕癥治療與人類輔助生殖技術(shù)實(shí)施中具有重要的地位。促性腺激素包括FSH、LH、HCG，F(xiàn)SH 及LH 是 主要參與卵泡生長發(fā)育的調(diào)控 ，特別是前者。目前含F(xiàn)SH的促性腺激素產(chǎn)品有HMG、uFSH、uFSH-HP 和rhFSH。而具有生物活性的FSH量明顯高于HMG， 可有效避免內(nèi)源性LH 過高或LH 峰提早出現(xiàn)， 提供更完善的生殖生理環(huán)境， 有利于改善子宮內(nèi)膜容受性、促進(jìn)優(yōu)勢卵泡發(fā)育， 獲得高質(zhì)量成熟卵母細(xì)胞?；蛑亟M技術(shù)使純化的FSH 用于臨床，克服了尿源性促性腺激素中大劑量LH 及其他雜質(zhì)的干擾，同時因其藥物濃度的一致性，在體外受精聯(lián)合胚胎移植技術(shù)（IVF）促排卵周期中較尿源性促性腺激素能獲得足量優(yōu)質(zhì)卵子，臨床上重組FSH也適用于治療PCOS中克羅米芬無反應(yīng)的患者。

本研究的超排卵實(shí)驗結(jié)果顯示rhFSH對正常大鼠的發(fā)情期血清性激素（FSH、E2、P、LH）水平影響沒有明顯影響，提示rhFSH對正常大鼠的促性腺激素分泌沒有明顯抑制；光學(xué)顯微鏡檢查結(jié)果，rhFSH組的大卵泡數(shù)目和小卵泡數(shù)目顯著增加；大鼠受孕實(shí)驗中rhFSH組受孕大鼠的胚胎數(shù)明顯增加。提示rhFSH對正常大鼠的超排卵作用。卵泡發(fā)育過程中， 卵泡刺激素（FSH）是重要的調(diào)控激素，通過外源性激素的注入，提高血液中激素濃度，降低發(fā)育卵泡的閉鎖，增加早期卵泡發(fā)育到成熟卵泡的數(shù)量，從而使雌性動物每次排卵數(shù)目增加。它在卵泡早中期給于超越竇卵泡所需求的閾值， 募集更多的卵泡達(dá)到多個卵泡發(fā)育的目的， 并可以刺激顆粒細(xì)胞的細(xì)胞色素P450 和芳香化酶的表達(dá)。雄激素彌散入顆粒細(xì)胞周圍， 并通過芳香化酶的作用轉(zhuǎn)化為雌激素， 足夠雌激素的產(chǎn)生對于成功受精和著床是必須的。黃體生成素（LH）主要作用于晚卵泡期，直接調(diào)控卵泡的成熟，促進(jìn)雄激素的合成， 刺激卵泡膜的17-a 羥化酶的活性。卵巢顆粒細(xì)胞在卵泡中晚期才表達(dá)LH 受體， 此時與FSH 共同作用， 促進(jìn)卵泡的發(fā)育。

本實(shí)驗進(jìn)行的rhFSH對大鼠無排卵動物的促排作用研究，采用動物模型是雄激素致不孕大鼠（ASR）模型，該大鼠成年后表現(xiàn)為高雄激素、低促性腺激素、無排卵和多囊卵巢等此模型無排卵，卵巢多囊性改變與人PCOS相似外，血清激素水平也符合人PCOS。本研究結(jié)果顯示模型組血清性激素水平FSH、E2、P、LH顯著低于正常對照組，而睪酮水平明顯高于正常對照組，呈現(xiàn)高雄激素血癥狀，它是PCOS的重要特征之一；陰道涂片檢查顯示模型組無動情周期變化，提示無卵泡排出；光學(xué)顯微鏡下卵巢組織學(xué)檢查顯示模型組卵泡呈囊性擴(kuò)張，少見卵母細(xì)胞與卵丘，幾乎無黃體，與文獻(xiàn)報道一致。與模型組相比，rhFSH組大鼠血清促卵泡激素、雌性激素水平有明顯的提高，子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)均有增加的趨勢，次級卵泡、成熟卵泡和黃體數(shù)目均明顯增加，提示rhFSH對PCOS無排卵大鼠卵泡發(fā)育有一定的促進(jìn)作用。

綜合以上，研究較為系統(tǒng)的評價了rhFSH對大鼠的促排卵作用，包括大鼠超排卵作用和對PCOS無排卵大鼠的促排卵作用，結(jié)果表明rhFSH對正常動物有明顯的促排卵作用，提高受孕率；對不排卵模型動物的卵泡發(fā)育也有明顯的促進(jìn)作用。

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