摘要：目的 通過研究細胞周期調(diào)控因子Rb及E2F-1在多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）骨髓活檢組織中的表達情況，探討它們對MM的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的影響及其作用機制。方法 采用免疫組織化學方法，檢測69例MM患者和15例對照者骨髓組織中Rb及E2F-1的表達情況。結(jié)果 Rb在MM組的表達強度明顯低于對照組（P<0.05）；E2F-1在MM組的表達強度明顯高于對照組（P<0.05）；隨著病理分期的增加，Rb陽性表達率及表達強度均有逐漸減低趨勢（P<0.05），而E2F-1則無明顯差異（P>0.05）；在不同分型組中，Rb和E2F-1陽性率及表達強度均無明顯差異（P>0.05）；Rb在治療前后CR（完全緩解）組陽性率及表達強度明顯高于NR（未完全緩解）組（P<0.05）。E2F-1在治療前CR組與NR組無明顯差異（P>0.05），治療后CR組的陽性率及表達強度明顯低于NR組（P<0.05）。相關(guān)性分析顯示：Rb與E2F-1在MM骨髓活檢中的表達呈負相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論 Rb低表達/缺失及E2F-1的高表達與MM的發(fā)生有密切關(guān)系。隨著MM疾病分期的增加，Rb有逐漸降低趨勢，與MM的預(yù)后有關(guān)。

關(guān)鍵詞：多發(fā)性骨髓瘤；Rb；E2F-1；骨髓活檢；免疫組化

多發(fā)性骨髓瘤是血液系統(tǒng)惡性腫瘤，病因尚不十分明確。Rb及E2F-1作為細胞周期調(diào)控因子在腫瘤發(fā)生過程中具有重要作用。本研究采用免疫組化方法檢測骨髓活檢組織中Rb及E2F-1表達情況，比較兩者在不同分組中陽性率及表達強度，分析它們在MM發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院血液科2010年6月～2012年6月確診的MM患者骨髓活檢標本共69例，MM診斷及療效標準參閱《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南2011修訂版》[1]。將69例MM骨髓活檢標本按多發(fā)性骨髓瘤ISS臨床分期標準分為：Ⅰ期21例，Ⅱ期20例，Ⅲ期28例；根據(jù)異常免疫球蛋白分泌情況分為四種類型：IgG型25例，IgA型19例，輕鏈型19例，其它型6例（其中包括IgD，不分泌型，IgM型及IgE型，由于病例數(shù)均偏少未做具體分析討論）。男38例，女31例，中位年齡61歲（28～81歲）。

69例MM患者均經(jīng)VAD方案（長春新堿0.4mg/d，靜點d1-4；阿霉素10mg/d，靜點d1-4；地塞米松40mg/d，靜點d1-4、9-12、17-20）化療6個療程后，其中有38例患者達到完全緩解（CR）；31例患者未達完全緩解（NR）。

收集同時期營養(yǎng)不良性貧血并除外惡性腫瘤患者骨髓活檢組織標本15例作為對照組，其中男7例，女8例，中位年齡53歲。MM組與對照組間年齡分布及性別比例無明顯差異（P>0.05）。

1.2主要試劑和免疫組化染色 兔抗人Rb單克隆抗體購自美國Bioword technology公司，兔抗人E2F-1單克隆抗體購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，DAB顯色劑、PV試劑盒等均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司，切片用鏈菌素親生物素-過氧化物酶連接法（strapta-vidin peroxides conjugate method， Sp方法）進行染色。

1.3染色結(jié)果判斷 細胞核或細胞漿中出現(xiàn)棕黃色染色即為陽性。結(jié)果判斷采用雙評分半定量法。隨機觀察5個高倍鏡下（×400）視野，每個視野計數(shù)200個細胞，共計1000個細胞，根據(jù)陽性細胞數(shù)和染色強度進行評分：陽性細胞數(shù)﹤5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，﹥50%為3分。顯色度按細胞顯色有無及深淺計分：細胞無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項相加為陽性強度總積分，0分為陰性表達（-），1～2分為低表達（+），3～4分為中度表達（++），5～6分為高表達（+++）。

1.4統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。應(yīng)用Chi-Square test檢測各指標在不同分組間陽性率的差別。不同分組間陽性積分的比較均采用非參數(shù)檢驗法分析，三組以上應(yīng)用Kruskal -Wallis H法，兩兩分組間的比較采用Mann-Whitney U檢驗。采用Pearson相關(guān)性檢驗分析兩種指標間的相關(guān)性。設(shè)P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1對照組中Rb及E2F-1的表達情況 Rb與E2F-1均定位于細胞核。15例對照組中有14例表達Rb，陽性率為93.33%，其中0例（+）、10例（++）、4例（+++）；5例表達E2F-1，陽性率為33.33%，其中4例（+）、1例（++）、0例（+++）。見表1。

2.2 Rb在MM骨髓活檢組織中的表達：MM組中有45例表達Rb，陽性率為65.22%，其中2例（+）、42例（++）、1例（+++），對照組陽性表達率及表達強度均明顯高于MM組（χ2 =4.659，P<0.05）。Ⅰ期中18例表達Rb，其中0例（+）、17例（++）、1例（+++）；Ⅱ期中13例表達Rb，其中0例（+）、13例（++）、0例（+++）；Ⅲ期中14例表達Rb，其中2例（+）、12例（++）、0例（+++）；三組間陽性率及表達強度存在明顯差異，Rb隨MM的臨床分期的增加呈減低趨勢（χ2 =6.748， H=14.283，P<0.05）。在四種不同分型組中，IgG型16例表達Rb，其中0例（+）、15例（++）、1例（+++）；IgA型13例表達Rb，其中1例（+）、12例（++）、0例（+++）；輕鏈型12例表達Rb，其中1例（+）、11例（++）、0例（+++）；其他型4例表達Rb，其中0例（+）、4例（++）、0例（+++）；四組間陽性率及表達強度差異無顯著性意義（χ2 =0.119， H=0.270，P>0.05）。在治療前，CR組29例表達Rb，其中2例（+）、26例（++）、1例（+++）；NR組16例表達Rb，其中0例（+）、16例（++）、0例（+++）；CR組陽性率及表達強度明顯高于NR組（χ2 =4.593，P<0.05）。在治療后，CR組35例表達Rb，其中4例（+）、20例（++）、11例（+++）；NR組21例表達Rb，其中5例（+）、11例（++）、5例（+++）；CR組陽性率及表達強度明顯高于NR組（χ2 =6.627，P<0.05），見表1。

2.3 E2F-1在MM骨髓活檢組織中的表達 MM組52例表達E2F-1，陽性率為75.36%，其中20例（+）、28例（++）、4例（+++），MM組陽性表達率及表達強度均明顯高于對照組（χ2 =9.979，P<0.05）。Ⅰ期中16例表達E2F-1，其中7例（+）、8例（++）、1例（+++）；Ⅱ期中15例表達E2F-1，其中7例（+）、6例（++）、2例（+++）；Ⅲ期中21例表達E2F-1，其中6例（+）、14例（++）、1例（+++）；三組間陽性率及表達強度差異無顯著性意義（χ2 =0.011， H=0.661，P>0.05）。在四種不同分型組中，IgG型18例表達E2F-1，其中9例（+）、9例（++）、0例（+++）；IgA型15例表達E2F-1，其中4例（+）、10例（++）、1例（+++）；輕鏈型14例表達E2F-1，其中4例（+）、7例（++）、3例（+++）；其他型5例表達E2F-1，其中3例（+）、2例（++）、0例（+++）；四組間陽性率及表達強度無顯著性差異（χ2=4.137，H=0.420，P>0.05）。在治療前，CR組29例表達E2F-1，其中12例（+）15例（++）、2例（+++）；NR組23例表達E2F-1，其中8例（+）、13例（++）、2例（+++）；兩組間陽性率及表達強度差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.041，P>0.05）。在治療后，CR組14例表達E2F-1，其中13例（+）、1例（++）、0例（+++）；NR組21例表達E2F-1，其中16例（+）、5例（++）、0例（+++）；CR組陽性率及表達強度明顯低于NR組（χ2=6.522，P<0.05），見表1。

2.4 Rb及E2F-1相關(guān)分析： Rb與E2F-1呈負相關(guān)（r=-0.317，P<0.05），見表2。

3 討論

Rb基因（成視網(wǎng)膜細胞瘤基因）是人類發(fā)現(xiàn)的第一個抑癌基因，定位于染色體13q14區(qū)，表達蛋白（Rb蛋白）是一種轉(zhuǎn)錄因子，位于細胞核內(nèi)。E2F-1基因定位于人類20號染色體的長臂：20q11·2，編碼的E2F-1 蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，與Rb一起參與調(diào)控細胞由G0/G1期向S期的過渡。Rb通過直接結(jié)合E2F-1抑制E2F-1轉(zhuǎn)錄活性，E2F-1結(jié)合Rb主要取決于Rb的磷酸化狀態(tài)，在G1早期，E2F-1與去磷酸化的Rb蛋白結(jié)合，E2F-1無活性，故無法發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用，在G1晚期細胞周期蛋白D/細胞周期蛋白依賴性激酶4/6和細胞周期蛋白E/細胞周期蛋白依賴性激酶2表達，導致Rb磷酸化，使E2F-1脫離Rb，從而啟動DNA的生物合成，細胞進入S期[2]。

Rb基因的突變或缺失與人類多種腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，它的失活是腫瘤最基本的事件[3]。至今已在視網(wǎng)膜母細胞瘤、食管癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)Rb基因的突變及表達缺失，表明Rb基因與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[4]。在人類許多腫瘤中已發(fā)現(xiàn)E2F-1調(diào)控的失靈[5]。Field等報道在E2F-1缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠中易有廣泛的腫瘤形成，如生殖道肉瘤、肺癌和淋巴瘤等。E2F-1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[6]。也有研究認為在某些腫瘤中E2F-1能誘導細胞凋亡，可能起抑癌的作用[7]。其具體機制尚不十分明確，但E2F-1作為人類腫瘤基因治療的一個新的靶點正日益受到關(guān)注。認識Rb和E2F-1在細胞周期調(diào)控的確切機制以及與腫瘤發(fā)生關(guān)系將有助于了解細胞生長與分化機制，并為腫瘤的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

在本實驗結(jié)果表明對照組中Rb陽性表達水平明顯高于MM組；在MM組中，Rb表達水平有隨MM臨床分期的增加而減低的趨勢；在四種不同分型組中，Rb表達水平無明顯差異；在MM治療前后CR組陽性表達率及表達強度均高于NR組。這說明Rb表達情況與MM的發(fā)生、臨床分期、預(yù)后有密切關(guān)系。E2F-1在MM組的陽性表達率及表達強度明顯高于對照組，在治療后CR組E2F-1陽性表達率及表達強度明顯低于NR組，MM組不同分期及不同分型中E2F-1陽性率及表達強度均無明顯差異。由此可以說明E2F-1可能在MM中起致瘤作用，E2F-1的高表達導致細胞過度增殖產(chǎn)生腫瘤，并且可以作為MM治療效果的指標，但與MM的分期及分型關(guān)系不明顯。

綜上所述，在MM中Rb及E2F-1均有表達，MM的發(fā)生可能與Rb缺失/低表達導致出現(xiàn)大量游離的E2F-1，加快了細胞從G1期進入S期進程，增殖失控導致腫瘤發(fā)生。因此Rb表達水平可作為評估MM病情的重要指標，Rb與E2F-1極有可能成為MM基因治療的新靶點。

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