摘要：目的 探討綠膿菌素（ PCN ）誘導(dǎo)U937細(xì)胞氧化損傷及抗氧化劑（NAC和PDTC） 對其損傷的保護(hù)作用。方法 選擇不同濃度PCN （5， 25和50μM）感染佛波酯（PMA）分化的U937細(xì)胞24h，選擇最佳濃度PCN （25μM）進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。給予不同濃度的 NAC（ 5， 10 or 20 mM）及PDTC （ 50、100、200μM） 預(yù)處理U937細(xì)胞1h ，PCN 感染細(xì)胞24h后，應(yīng)用試劑盒進(jìn)行丙二醛（ MDA ）、乳酸脫氫酶（ LDH）、超氧化物歧化酶 （SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性以及谷胱甘肽（GSH）含量測定。結(jié)果 與正常對照組相比，模型組LDH漏出量增加，MDA含量增加，SOD及CAT活性下降，GSH含量下降，呈劑量依賴關(guān)系。與模型組相比，NAC及PDTC干預(yù)組均呈LDH漏出量減少，MDA含量減少，SOD及CAT活性升高，GSH含量增加，呈濃度依賴關(guān)系，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 PCN可以誘導(dǎo)U937細(xì)胞氧化損傷，并呈劑量依賴關(guān)系， NAC及PDTC對PCN誘導(dǎo)J774細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：綠膿菌素；氧化損傷； U937細(xì)胞； N-乙酰半胱氨酸； PDTC

綠膿菌素（pyocyanin，PCN）是銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）產(chǎn)生的一種藍(lán)色的有活性的氧化還原次級代謝產(chǎn)物，能自由地穿透生物膜、干擾正常離子轉(zhuǎn)運(yùn)、打斷細(xì)胞呼吸鏈、過量產(chǎn)生氧自由基導(dǎo)致細(xì)胞死亡，PCN被認(rèn)為是氧化還原的活性產(chǎn)物，是重要的致病因子和促炎介質(zhì)。近年研究顯示[1]，PCN在A549人肺泡上皮細(xì)胞株和人支氣管上皮細(xì)胞，能鈍化過氧化氫酶，減少基因編碼的過氧化氫酶的轉(zhuǎn)錄，在肺上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，PCN也可調(diào)整谷胱甘肽（GSH）氧化還原周期性變化[2，3] ，提示氧自由基和氧化還原反應(yīng)在PCN介導(dǎo)的損傷中具有重要作用。

目前關(guān)于PA與抗氧化劑的研究較多，然而，關(guān)于PCN與單核巨噬細(xì)胞氧化損傷，以及抗氧化劑之間的研究報(bào)告較少。本研究選用佛波酯分化后的U937細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞模型，研究綠膿菌素感染巨噬細(xì)胞導(dǎo)致氧化損傷，并探討抗氧化劑（包括NAC及PDTC）對巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用，研究綠膿菌素感染宿主的發(fā)病機(jī)制，為今后PA感染的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑 人白血病細(xì)胞株U937購自北京中科院細(xì)胞中心，用含10%小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。RPMI 1640 購自華美公司，小牛血清購自Gibco公司，綠膿菌素購自Sigma公司，NAC及PDTC購自大連寶生物公司，谷胱甘肽檢測試劑盒，南京建成生物工程公司，其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分化 常規(guī)進(jìn)行U937細(xì)胞傳代培養(yǎng)。取5-30代U937細(xì)胞（細(xì)胞濃度達(dá)1×109/L），應(yīng)用PMA（10μg.L -1）誘導(dǎo)U937細(xì)胞分化，分化成熟后的U937細(xì)胞作為細(xì)胞模型用于以下實(shí)驗(yàn)[4，5]。

1.3 綠膿菌素感染細(xì)胞試驗(yàn) 將PMA分化的U937細(xì)胞洗滌后，將5、10、25μM綠膿菌素加入含U937細(xì)胞的培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下孵育24h。收集培養(yǎng)上清，保存于-80℃冰箱中。

1.4 噻唑藍(lán)（MTT）毒性實(shí)驗(yàn) 選擇570 nm作為測試波長，于酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上檢測各孔光吸收值（A值）并記錄結(jié)果，應(yīng)用MTT還原法進(jìn)行檢測。以吸光值為縱坐標(biāo)、時間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。通過如下公式進(jìn)行細(xì)胞生長抑制率計(jì)算：即細(xì)胞生長抑制率/% = 1 - 實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%。

1.5 LDH 活性及過氧化氫酶（CAT）活性檢測 分別取細(xì)胞上清液，根據(jù)試劑盒的要求測定LDH及CAT活性。

1.6 MDA含量測定及SOD活性檢測 分別取細(xì)胞上清液，根據(jù)試劑盒的要求測定MDA及SOD活性。

1.7 GSH含量測定 GSH含量的檢測：利用二硫代二硝基苯甲酸與還原型GSH上的巰基反應(yīng)，對生成的黃色化合物進(jìn)行比色定量，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。蛋白含量的測定采用Bradford法進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料以（x±s）表示，計(jì)量資料用Compare Means中的One-way ANOVA，組間兩兩比較采用Dunnett- t檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 U937細(xì)胞的分化 U937細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)為單個懸浮細(xì)胞。將U937細(xì)胞與10μg.L -1 PMA共培養(yǎng)8 h后，細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生改變：即由懸浮的、獨(dú)立的小圓形細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁的、成團(tuán)的、不規(guī)則狀的細(xì)胞，狀似阿米巴形態(tài)；48 h后，約80%的細(xì)胞貼壁生長。

2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 為評估PCN、NAC及PDTC對細(xì)胞活力的影響，選用PCN （5， 25和50 μM） 、NAC（ 5， 10，20 mM）、PDTC （ 50，100，200μM）與PMA分化的U937細(xì)胞分別共培養(yǎng)24 h，通過MTT法行毒性檢測。結(jié)果顯示，以上各種濃度對細(xì)胞活力均無影響，故選用以上相應(yīng)濃度進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。

2.3 PCN對PMA分化的U937細(xì)胞氧化指標(biāo)的影響 選用不同濃度的PCN（5，25，50 μM）感染U937細(xì)胞24h，然后收集細(xì)胞上清，應(yīng)用試劑盒分別檢測MDA含量、LDH漏出量、 CAT及SOD活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組各組的MDA含量增加，LDH漏出量增加，CAT及SOD活性下降，且呈劑量依賴關(guān)系，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。結(jié)果表明，PCN能誘導(dǎo)U937細(xì)胞氧化損傷。

2.4 NAC對PCN 感染PMA分化的U937細(xì)胞各氧化指標(biāo)的影響 NAC（5， 10，20 mM）預(yù)處理PMA分化的U937細(xì)胞1h，選擇PCN（25μM）感染U937細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞上清并檢測上述指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與模型組相比，不同濃度NAC干預(yù)組MDA含量減少，LDH 漏出量減少，CAT及SOD活性升高，且呈劑量依賴關(guān)系，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NAC具有抗氧化損傷作用。

2.5 PDTC對PCN 感染PMA分化的U937細(xì)胞各氧化指標(biāo)的影響 PDTC （ 50，100，200μM） 預(yù)處理PMA分化的U937細(xì)胞1h，PCN（25μM）感染細(xì)胞24h，收集上清并檢測上述指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與模型組比較，不同濃度PDTC干預(yù)組MDA含量減少，LDH 漏出量減少，CAT及SOD活性升高，且呈劑量依賴關(guān)系，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PDTC具有抗氧化損傷作用。

2.6 PCN對PMA分化的U937細(xì)胞GSH含量的影響 研究表明，PCN直接氧化谷胱甘肽，降低其在氣道上皮細(xì)胞的水平[3]。本實(shí)驗(yàn)選用不同濃度的PCN（5，25，50 μM）刺激PMA分化的U937細(xì)胞24h，然后收集細(xì)胞上清，應(yīng)用GSH試劑盒測定其含量，觀察PCN作用于U937細(xì)胞后GSH含量的變化。結(jié)果顯示：與對照組相比，不同濃度模型組GSH含量減少，呈濃度依賴關(guān)系，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），見表1。

注：*P < 0.05， compared with control； **P < 0.01， compared with control.

2.7 NAC對PCN 感染PMA分化的U937細(xì)胞GSH含量的影響 NAC（5， 10，20 mM）預(yù)處理PMA分化的U937細(xì)胞1h，選擇PCN（25μM）感染U937細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞上清并檢測GSH。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與模型組比較，不同濃度NAC干預(yù)組GSH含量增加且呈劑量依賴關(guān)系，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

注：Notice：Control： Controlgroup； PCN2：PCN（25μM） ； NAC1（5 mM）； NAC2（10mM）； NAC3（20mM）；*P < 0.05， compared with control； **P < 0.01， compared with control； @P < 0.05， compared with PCN2 ； @@P < 0.01， compared with PCN2

2.8 PDTC對PCN 感染PMA分化的U937細(xì)胞GSH含量的影響 PDTC （ 50，100，200μM）分別預(yù)處理PMA分化的U937細(xì)胞1h，選擇PCN（25μM）感染U937細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞上清并檢測GSH。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與模型組比較，不同濃度PDTC干預(yù)組GSH含量增加且呈劑量依賴關(guān)系，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

注：Notice：Control：Controlgroup；PCN2：PCN（25μM） ； PDTC （ 50μM）；PDTC （ 100μM）；PDTC （ 200μM）. *P < 0.05， compared with control； **P< 0.01， compared with control. @P< 0.05， compared with PCN2 ； **P < 0.01， compared with PCN2

3 討論

通過PMA、維生素D3等作用后的U937細(xì)胞具有人單核/巨噬細(xì)胞功能，因此作為巨噬細(xì)胞模型廣泛用于實(shí)驗(yàn)研究。作為重要的機(jī)體免疫防御細(xì)胞，巨噬細(xì)胞氧化損傷后，其吞噬能力下降，易受各種病原體感染，如細(xì)菌、病毒等。抗氧化酶能保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，許多抗氧化酶在細(xì)胞受到氧化損傷時可維持細(xì)胞的基本功能，如在過氧化氫酶（CAT）及過氧化物酶（GPX）作用下可分解為水和氧，致使細(xì)胞無毒化。作為細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，MDA含量增多可增加細(xì)胞氧化損傷程度。

銅綠假單胞菌為重要院內(nèi)感染致病菌，耐藥性高，感染機(jī)制復(fù)雜，治療棘手。體外研究發(fā)現(xiàn)，PA可分泌多種毒力因子如鞭毛蛋白、PCN、還原蛋白等，這些毒力因子可感染氣道上皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，引起細(xì)胞損傷，并可導(dǎo)致嚴(yán)重的氧化損傷。研究還發(fā)現(xiàn)，PCN直接氧化谷胱甘肽，降低其在氣道上皮細(xì)胞的水平[3]。生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)維持在一定水平，以清除生理代謝過程中產(chǎn)生的自由基，避免其與蛋白、核酸等生物大分子反應(yīng)而損傷細(xì)胞。如在外來刺激作用下，細(xì)胞可產(chǎn)生大量自由基，抗氧化系統(tǒng)被調(diào)動起來。GSH系水溶性小分子抗氧化劑，分為氧化型和還原型，在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)中有重要的作用，參與許多氧化物質(zhì)如H2O2，ROOH等的解毒過程。而且由于其本身易受自由基氧化，從而保護(hù)體內(nèi)更多蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基不被氧化，保護(hù)正常組織細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，PCN感染PMA分化的U937細(xì)胞后，導(dǎo)致LDH漏出量增加，MDA含量增加，SOD及CAT活性下降，GSH水平降低，上述各指標(biāo)呈劑量依賴關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PCN可能誘導(dǎo)U937細(xì)胞氧化損傷，產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致MDA含量增加，以及抗氧化酶類活性降低的氧化應(yīng)激表現(xiàn)，與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

作為強(qiáng)有力的抗氧化劑，PDTC及NAC具有清除自由基功能。如NAC進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)生去乙?；⑸砂腚装彼?，可促進(jìn)GSH合成，而GSH是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的主要力量?，F(xiàn)有研究表明吸入谷胱甘肽（GSH）或其合成的前體NAC，可增加肺囊性纖維化患者降低的GSH 水平，并減輕PA 引起宿主的氧化損傷。PDTC不僅是公認(rèn)的NF-KB抑制劑，也是一種抗氧化劑，可通過直接清除活性氧、增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶活力，糾正PCN感染后氧化還原系統(tǒng)的失衡。本研究結(jié)果顯示：NAC及PDTC干預(yù)組均呈LDH漏出量減少，MDA含量減少，SOD及CAT活性升高，GSH含量增加，呈濃度依賴關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)充外源性抗氧化劑后，有利于自由基的清除及機(jī)體氧化/抗氧化機(jī)制的平衡。NAC及PDTC對PCN誘導(dǎo)的U937細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，二者可能通過抗氧化效應(yīng)而發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)：

[1] OMalley YQ，Reszka KJ，Rasmussen GT，et a1. The Pseudomonas secretory product pyocyanin inhibits catalase activity in human lung epithelial cells[J].Am J Physiol Lung Cell M ol Physiol，2003，285：L1077-L1086.

[2] M uller M .Pyocyanin induces oxidative stress in hum an endothelial cells and modulates the glutathione redox cycle[J].Free Radic Biol M ed，2002，33：1527-1533.

[3] OMalley YQ，Reszka KJ，Spitz DR，et a1. Pseudomonas aeruginosa pyocyanin directly oxidizes glutathione and decreases its levels in airway epithelial cells[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2004，287：L94-L103.

[4] Denning G M， Wollenweber L A ， Railsback M A ， et al .Pseudomonas pyocyanin increases interleukin-8 expression by humanairway epithelial cells[J].Infect and Immun，1998，66（12）：5777-57841.

編輯/王海靜