摘要：目的 觀察急性心肌梗死患者血漿mir-223-3p的表達(dá)情況，分析血漿mir-223-3p用于急性心肌梗死（AcuteMyoeardialInfraetions，AMI）臨床診斷的可能性。方法 選擇AMI患者29例，陳舊性心肌梗死患者31例，健康志愿者10例，入院后1h、24h、2d、7d分別抽取肘靜脈血。real-timePCR檢測(cè)mir-223-3p表達(dá)水平，改良szasz法檢測(cè)CK-MB，免疫印記法檢測(cè)cTnI。結(jié)果 AMI患者血漿mir-223-3p表達(dá)水平較陳舊性心肌梗死患者及健康組均顯著升高（P<0.01），陳舊性心肌梗死患者與健康組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。AMI患者入院1h血漿mir-223-3p表達(dá)水平已達(dá)到峰值，24h后明顯降低，第2d基本進(jìn)入平臺(tái)期，并持續(xù)至第7d，但仍明顯高于陳舊性心肌梗死患者與健康組入院時(shí)的水平（P<0.01）。mir-223-3p表達(dá)水平與cTnI和CK-MB均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為（r=0.848，P=0.000）、（r=0.804，P=0.000）。結(jié)論 mir-223-3p在AMI早期表達(dá)水平明顯升高，而且擁有較cTnI和CK-MB更早的時(shí)間窗，提示mir-223-3p對(duì)AMI早期診斷具有一定價(jià)值。

關(guān)鍵詞：急性心肌梗死；mir-223-3p；CK-MB；cTnI

隨著現(xiàn)代社會(huì)生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，急性心肌梗死（AcuteMyoeardialInfraetions，AMI）的發(fā)病率逐年增加，在我國已成為一種嚴(yán)重危害人民群眾健康的重要疾病。因此，對(duì)AMI的預(yù)防及治療成為當(dāng)前一項(xiàng)重要課題。近年來發(fā)現(xiàn)的miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著極為密切的關(guān)系。最近研究表明，miRNA廣泛參與調(diào)控心血管系統(tǒng)的發(fā)育和疾病發(fā)生過程，并且具有較高的組織特異性，在外周血中可以穩(wěn)定存在而不被分解，推測(cè)miRNA可能是一個(gè)理想的生物檢測(cè)標(biāo)志物。

1資料與方法

1.1一般資料 取得患者知情同意后，收集山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心病科2012年8月～2013年12月，29例AMI患者（參照2012年ESC/ACC/AHA/WHF工作聯(lián)盟發(fā)布修訂后的第3版心肌梗死全球統(tǒng)一定義）、31例陳舊性心肌梗死患者、10例老年健康體檢者。

1.2主要試劑和儀器 低溫高速離心機(jī)（美國ThermoScientific公司），熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀7300型（美國Appliedbiosystems公司），Trizol（美國Invirotrogen公司），TIANScriptRTKIT反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京天根生化科技公司），SYBRPremixExTaqTMreal-time-PCR試劑盒（大連TaKaRa公司），引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.3指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1標(biāo)本采集 分別于入院后1h、24h、2d、7d經(jīng)肘靜脈穿刺采集受試者外周血5ml，置于含EDTA的抗凝管中，靜置30min；室溫3000rpm離心15min，小心提取上清液分裝到去RNA酶的EP管中，置于-80℃低溫冰箱中保存待用。用于檢測(cè)cTnI、CK-MB的外周血與用于miRNA提取的外周血同時(shí)采集，置于內(nèi)含促凝劑（惰性分離膠）的真空采血管（BD公司生產(chǎn)）內(nèi)，及時(shí)送化驗(yàn)室檢驗(yàn)。

1.3.2real-timePCR檢測(cè)mir-223-3p 按照Trizol途徑提取總RNA，紫外測(cè)總RNA的純度及濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；選用miR-93作為內(nèi)參，逆轉(zhuǎn)錄引物序列如下：miR-223-3p：GSP：5'GGGGTGTCAGTTTGTCAAA3'，R：5'CAGTGCGTGTCGTGGAGT3'；miR-93：GSP：5'GGCAAAGTGCTGTTCGTG3'R：5'CAGTGCGTGTCGTGGAGT3'，注：GSP是對(duì)應(yīng)miRNA的特異引物，R是與RT引物相匹配的引物。real-timePCR按照說明書進(jìn)行操作；反應(yīng)條件為：95℃，10min；40個(gè)PCR循環(huán)（95℃，10s；60℃，60s（收集熒光））。為了建立PCR產(chǎn)物的融解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按（95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s）；并從60℃緩慢加熱到99℃（儀器自動(dòng)進(jìn)行-RampRate為0.05℃/s）。獲得產(chǎn)物擴(kuò)增曲線與融解曲線及CT值。

1.3.3檢測(cè)CK-MB、cTnI 應(yīng)用改良szasz法檢測(cè)CK-MB，采用免疫印記法檢測(cè)cTnI。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，計(jì)算各樣本的△Ct值（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值），各樣本的相對(duì)定量為2-△Ct，mir-223-3p組間表達(dá)差異用2-△△Ct（△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，以P<0.05表示具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01表示結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有極顯著的差異。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1一般資料分析 本次試驗(yàn)納入AMI患者29例，男16例，女13例，平均年齡（59.21±7.39）歲，陳舊性心肌梗死患者31例，男17例，女14例，平均年齡（58.74±6.91）歲，健康志愿者10例，男5例，女5例，平均年齡（56.63±4.89）歲。各組之間在年齡及性別構(gòu)成上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），消除了年齡及性別因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。為排除冠心病相關(guān)因素高血壓、糖尿病、吸煙、高脂血癥對(duì)mir-223-3p表達(dá)量的影響，分別對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果各組之間mir-223-3p表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。說明mir-223-3p在外周血中的表達(dá)與冠心病危險(xiǎn)因素?zé)o明顯相關(guān)性。

2.2入院后各組受試者血漿mir-223-3p水平比較 AMI患者、陳舊性心肌梗死患者和健康者三組血漿mir-223-3p表達(dá)量比較，AMI患者入院后1hmir-223-3p表達(dá)水平較陳舊性心肌梗死患者和健康者均明顯升高且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，P<0.01），陳舊性心肌梗死患者與健康組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組mir-223-3p表達(dá)量（見表1）。

2.3AMI患者不同時(shí)間窗血漿mir-223-3p水平比較 AMI患者入院1h血漿mir-223-3p水平即達(dá)到峰值，入院24h開始降低，在第2d時(shí)下降趨勢(shì)趨于緩慢，基本進(jìn)入平臺(tái)期，并持續(xù)到第7d。（見表2，圖1）。

圖1 AMI患者不同時(shí)間窗血漿mir-223-3pCt值

2.4 mir-223-3p與cTnI、CK-MB的相關(guān)性分析 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)AMI患者入院后1h、24h、2d、7dcTnI、CK-MB表達(dá)水平（見表3）。入院1h出現(xiàn)升高，24h達(dá)到峰值，第2d開始明顯下降，第7d時(shí)進(jìn)一步降低，并接近正常水平。結(jié)果提示mir-223-3p與cTnI、CK-MB表達(dá)水平在AMI入院早期均迅速升高，但mir-223-3p表達(dá)水平升高具有更早的時(shí)間窗以及更早的達(dá)峰時(shí)間（見圖1～圖3）。AMI患者血漿mir-223-3p水平與cTnI、CK-MB水平的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，mir-223-3p表達(dá)水平與cTnI和CK-MB均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為（r=0.848，P=0.000）；（r=0.804，P=0.000）。（見圖4）。

圖2 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)cTnI表達(dá)水平變化

圖3動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CK-MB表達(dá)水平變化

3討論

近年來心血管疾病己經(jīng)超過癌癥成為威脅人類健康最主要的疾病，心血管疾病死亡率達(dá)16.77%，僅次于惡性腫瘤及腦血管疾病[1]。因此AMI早期及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷，采取積極有效的治療措施保證心臟及時(shí)再灌注以減少死亡率及改善預(yù)后具有重要臨床意義[2]。目前用于AMI臨床診斷的血清生物標(biāo)志物主要有CK-MB、肌紅蛋白、cTn等[3，4]，然而考慮到上訴標(biāo)志物在敏感性及特異性上的缺陷，對(duì)高敏感性及高特異性生物標(biāo)志物的探求仍然是目前研究的焦點(diǎn)。近年來新發(fā)現(xiàn)的miRNA與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有著極為密切的關(guān)系[5～9]，miRNA具有較高的組織特異性、在血液中具有較高穩(wěn)定性，推測(cè)miRNA可能是一個(gè)理想的生物檢測(cè)標(biāo)志物。

隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，心肌梗死早期較正常組出現(xiàn)多種miRNA表達(dá)水平的異常，而且其表達(dá)水平具有明顯的時(shí)效性，如miR-499[10]在大鼠心肌梗死1～3h開始升高，12h內(nèi)

達(dá)到高峰，24h開始減少。另外，對(duì)miRNA-1[11]、miRNA-208[12]、miRNA-133[13]的相關(guān)研究亦顯示miRNA有潛力作為心肌梗死標(biāo)志物。并且隨著心肌損傷及心功能的衰減，miRNA的種類及數(shù)量同樣發(fā)生變化，這對(duì)于下一步研究相關(guān)miRNA的作用機(jī)制同樣具有指導(dǎo)意義。

本研究從己經(jīng)由AMI動(dòng)物模型證實(shí)的相關(guān)miRNA中篩選出mir-223-3p，通過抽取AMI、陳舊性心肌梗死及健康體檢者血漿中的mir-223-3p，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)出mir-223-3p在不同受試者間的差異性表達(dá)，進(jìn)一步分析其對(duì)AMI的診斷作用。AMI患者、陳舊性心肌梗死患者和健康者三組血漿mir-223-3p表達(dá)水平比較，AMI患者入院后1hmir-223-3p表達(dá)水平較陳舊性心肌梗死患者和健康者明顯升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，P<0.01），陳舊性心肌梗死患者與健康組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。mir-223-3p在AMI早期表達(dá)水平明顯升高，而且擁有較cTnI、CK-MB更早的時(shí)間窗，AMI患者血漿mir-223-3p水平與cTnI水平Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，mir-223-3p表達(dá)水平與cTnI和CK-MB均呈正相關(guān)，提示mir-223-3p對(duì)AMI早期診斷具有一定價(jià)值，不僅能夠幫助我們更及時(shí)的診斷AMI，而且能夠作為cTnI/T、CK-MB的輔助標(biāo)記物，進(jìn)一步提高AMI的確診率，從而為AMI的再灌注治療節(jié)約寶貴的時(shí)間。

雖然目前關(guān)于mir-223-3p的作用機(jī)制研究還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，但這并不能否定它對(duì)AMI潛在的診斷價(jià)值，循環(huán)miRNA分子標(biāo)志物將改變和補(bǔ)充傳統(tǒng)AMI實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)。盡管目前對(duì)循環(huán)miRNAs的研究眾多，循環(huán)miRNAs在心血管系統(tǒng)中的生物學(xué)行為仍然是一個(gè)新的研究領(lǐng)域，作為AMI的診斷生物標(biāo)志物仍有諸多問題尚待解決，例如：相關(guān)研究均存在樣本量小，受試病種單一的缺陷，具體選擇哪一種循環(huán)miRNAs作為AMI生物標(biāo)記物也并不十分明朗，檢測(cè)技術(shù)的操作過程相對(duì)復(fù)雜等。但是，循環(huán)miRNAs的發(fā)現(xiàn)為AMI的診斷和治療提供了新的思路和方法，我們相信miRNA作為生物標(biāo)志物是一個(gè)很有前途的研究領(lǐng)域，隨著技術(shù)的進(jìn)步和應(yīng)用，這個(gè)時(shí)代一定會(huì)提前到來。

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