摘要：目的 探討索拉菲尼對不同人肝癌細胞株抑制增殖、促進凋亡作用及敏感性。方法 體外培養(yǎng)肝癌細胞株Huh7、 MHCC97H、 HepG2 、SMCC7721、 HepG2.2.15、PLC，各細胞株分為實驗組及對照組，以不同濃度索拉菲尼對實驗組進行干預，通過CCK8法檢測出不同細胞株細胞凋亡的IC50值，實驗組與對照組再進行流式細胞學對比檢測分析，進而得出對索拉菲尼相對敏感及不敏感肝癌細胞株。結果 索拉菲尼對六種人肝癌細胞株PLC、HepG2.2.15、Huh7、HepG2、MHCC97H、SMCC7721均有明顯的促凋亡作用，對它們作用的IC50值分別為5.3umol/L、5.3umol/L、6.8umol/L、7.0umol/L、11. 7umol/L、15.0umol/L。結論 索拉菲尼對人肝癌細胞株Huh7、 MHCC97H、 HepG2 、SMCC7721、 HepG2.2.15、PLC均有明顯的抑制增殖和促凋亡作用，其作用相對敏感細胞株和不敏感細胞株分別為PLC和SMCC7721。

關鍵詞：索拉菲尼；肝癌；細胞株；凋亡

索拉菲尼（Sorafenib，商品名：多吉美）是一個多靶點的分子靶向藥物，對Raf-1激酶，VEGFR2、3，F(xiàn)LT3，Ret、C-kit，PDGFR等靶點有抑制作用[1～3]。 目前已有多項研究證明索拉菲尼對晚期原發(fā)性肝細胞癌（HCC）有明顯、確切的療效，能明顯延長晚期肝癌的生存時間[4～6]。但在針對索拉菲尼對不同人肝癌細胞株的各項實驗研究結果中，其對不同細胞株的作用效果存在差異[4，7]。本研究以肝癌細胞株Huh7、 MHCC97H、 HepG2 、SMCC7721、 HepG2.2.15、PLC為研究對象，通過實驗得出它們不同的IC50值，并且選出對索拉菲尼相對敏感及不敏感細胞株，為將來相關實驗研究的細胞株選擇提供參考。

1資料與方法

1.1一般資料 人肝癌細胞株Huh7、HepG2 、SMCC7721、 PLC（中國科學院上海細胞庫），HepG2.2.15購自上海復祥生物科技有限公司，MHCC-97H（上海中山醫(yī)院肝癌研究所），CCK8試劑盒（美國Sigma公司），Annexin-PE/7-A凋亡檢測試劑盒（美國BectonDickinson公司）， 索拉菲尼（德國拜耳免費提供）。

1.2方法

1.2.1細胞準備 將各HCC細胞株接種在含10%小牛血清，1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長良好呈單層貼壁生長，將于對數(shù)生長期的各株細胞計數(shù)并制成細胞懸液，，低倍顯微鏡下逐一計數(shù)4大格的細胞數(shù)。計數(shù)板上每大格含16小格，計數(shù)時每小格在上、左的壓線細胞計入，而壓線于下、右的細胞排除不計。計數(shù)完成后按細胞密度公式計算：細胞懸液的細胞數(shù)/ml=（四個大格子細胞數(shù)/4）×104 。反復操作細胞計數(shù)3次取平均值以確保結果準確。每種細胞株設對照組（細胞懸液+DMSO）、實驗組（細胞懸液+索拉菲尼）。

1.2.2流式細胞學檢測 將濃度為2×105/ml呈指數(shù)生長的細胞懸液接種于6孔板，每孔2.5ml（即5×105/孔），細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1d，對照組每孔加入0.5mlDMSO，實驗組每孔加入索拉菲尼0.5ml溶液（終濃度為4uM），每組設三個復孔，然后置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3d，不含EDTA的胰酶消化收集、離心細胞，PBS液洗滌2次（每次均以2000rpm離心5min），以500ul的Binding Buffer重懸細胞，先后加入5ul Annexin V-FITC和5ul Propidium Iodide，混勻，室溫避光反應10min，在1h內(nèi)上流式細胞儀檢測記錄結果。流式細胞儀參數(shù)設定：激發(fā)波長Ex=488nm，發(fā)射波長Em=530nm；Annexin V-FITC的綠色熒光和PI紅色熒光分別通過FL1和FL3通道檢測。

1.2.3CCK8法檢測 每種細胞設空白組（培養(yǎng)液+CCK-8）、對照組（細胞+培養(yǎng)液+CCK-8）、實驗組（細胞+培養(yǎng)液+索拉菲尼+CCK-8）。調(diào)整細胞懸液濃度為5x107/L，96孔板中每種細胞各組設4個不同索拉菲尼作用濃度，每個濃度設3個復孔，對照組內(nèi)加入培養(yǎng)液200ul，實驗組內(nèi)加入不同量的索拉菲尼溶液，余量液體用培養(yǎng)液補足，使每孔液體量為200ul，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h；各組每孔加入10ul CCK-8溶液，放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h。酶標儀在450nm波長比色測定每孔吸光度（A）值，記錄結果。細胞存活率（%）= [（Aa-Ab）/（Ac-Ab）]×100%，Aa：實驗孔，Ab：空白孔，Ac：對照孔。IC50值為細胞存活率為50%時的索拉菲尼濃度。

1.3統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件分析。流式細胞、CCK-8復孔結果都以（x±s）表示，不同實驗方法各組細胞株的實驗組與對照組比較用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

流式細胞檢測 每株細胞流式細胞儀檢測取\"十字門\"的右上象限（UR）的讀數(shù)結果，Huh7、 MHCC97H、 HepG2 、SMCC7721、 HepG2.2.15、PLC實驗組肝癌細胞株經(jīng)索拉菲尼作用后凋亡均較對照組明顯增加（P<0.05）（見圖1），從凋亡細胞百分比直方圖上可以看出，對索拉菲尼較敏感細胞株為PLC和HepG2.2.15，對其相對不敏感細胞株為SMCC7721和MHCC97H（見圖2）。

CCK8測索拉菲尼對各肝癌細胞株存活率的結果 索拉菲尼對六種人肝癌細胞株PLC、HepG2.2.15、Huh7、HepG2、MHCC97H、SMCC7721均有明顯的促凋亡作用，其IC50值分別為5.3umol/L、5.3umol/L、6.8umol/L、7.0umol/L、11. 7umol/L、15.0umol/L。對索拉菲尼相對敏感細胞株和不敏感細胞株分別為PLC和SMCC7721（見圖3）。

3討論

近幾年來出現(xiàn)的新型口服的分子靶向抑制藥物索拉菲尼，經(jīng)過三期臨床實驗證實療效后已應用于治療晚期HCC患者， 多項研究證明索拉菲尼對晚期HCC有明顯確切的療效[4～6]，索拉菲尼已被確立成為晚期HCC的一線標準治療[8]。

以往研究表明，索拉菲尼抗腫瘤機制主要是抑制Raf，下調(diào)pMEK、pERK表達抑制HCC細胞系的增殖，誘導HCC細胞凋亡，靶向抑制VEGFR和PDGFR抗腫瘤血管生成[3]，與血管形成有關因子如VEGF、PDGF 等在腫瘤細胞及其周圍環(huán)境均異常高表達，這與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關，也與新生腫瘤血管的形成、門靜脈癌栓和周圍侵犯有聯(lián)系[9]。PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路在腫瘤細胞增生、分化、生長、代謝、轉(zhuǎn)移的過程中起重要作用[10]。以上檢測索拉菲尼作用的實驗研究中，常用的細胞株有Huh7、 MHCC97H、 HepG2 、SMCC7721、 HepG2.2.15、PLC，但索拉菲尼干預在各實驗研究的結果有不同之處[3，4]，如索拉菲尼作用HepG2細胞株后的IC50就有（4.5±1.6）umol/L、（7.3±1.3）umol/L等不同數(shù)值[3，9]，其原因可能是由于實驗誤差、細胞株傳代差別、索拉菲尼藥品制備過程的不同造成，目前尚無實驗將以上各細胞株納入統(tǒng)一研究，這樣就給后來的研究者在閱讀文獻時帶來困惑，亦對預選進行實驗的細胞株帶來困難。

本實驗以索拉菲尼干預不同肝癌細胞株為研究對象，通過流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼對實驗組肝癌細胞株Huh7、 MHCC97H、 HepG2 、SMCC7721、 HepG2.2.15、PLC抑制生長和促凋亡作用均明顯強于對照組（P<0.05）。用不同濃度的索拉菲尼作用于這些細胞株，結果發(fā)現(xiàn)細胞株不同其IC50值有差異，人肝癌細胞株PLC的IC50值為5.3umol/L、HepG2.2.15的IC50值為5.3umol/L、Huh7的IC50值為6.8umol/L、HepG2的IC50值為7.0umol/L、MHCC97H的IC50值為11. 7umol/L、SMCC7721的IC50值為15.0umol/L。本實驗驗證了索拉菲尼對肝癌細胞株的抑制生長和促凋亡作用，此結論與以上提出的實驗相同，我們同時還篩選出對索拉菲尼相對敏感細胞株和不敏感細胞株分別為PLC和SMCC7721，可為將來相關實驗研究的細胞株選擇提供參考。

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編輯/王海靜