摘要：目的 ELISA技術在臨床實驗室的應用日漸廣泛，成為快速診斷和確診臨床疾病的一項免疫診斷技術。但是，到目前為止國家相關部門尚未出臺相應的實驗條件要求、人員培訓以及標準的操作流程，同時該技術實驗操作和結果判斷等環(huán)節(jié)較多，對臨床結果影響較大，鑒于此，我們就目前臨床實驗中需要關注的地方進行闡述，以便更好地改進規(guī)范性實驗技術步驟，有效減少臨床檢驗的誤診。方法 用試劑盒中抗-HBc，抗-HBe陰性對照標本按照操作說明書加樣后，分別于0，5，10，15，20，30min后加入酶標記物。結果 不同加酶時間可出現(xiàn)程度不同的假陽性，間隔時間越長，標本的假陽性越多。結論 不同加酶時間可出現(xiàn)程度不等的抗-HBc，抗-HBe抗體假陽性。為避免這種假陽性結果導致的差錯，建議嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

關鍵詞：假陽性；抗-HBc，抗-HBe；酶聯(lián)免疫吸附試驗

乙型肝炎病毒（HBV）血清標志物的5項指標檢測方法較多，但是目前臨床應用最多的還是酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），其中抗-HBc，抗-HBe采用競爭抑制法。

1 資料與方法

1.1試劑與材料

1.1.1質控品 購于貴州省臨檢中心質控品：20130111W，20130108W。

1.1.2試劑 均由珠海麗珠試劑股份有限公司提供。

1.1.3儀器 北京天石SM-3酶標儀；北京天石ZMX 988 B洗板機；上海醫(yī)療器械七廠HH.W21.Cu600型水浴箱。

1.1.4樣本 血液樣本來自本單位住院、門診患者，真空抽血5ml，分離血清待檢，共235份；用試劑盒中抗-HBc，抗-HBe陰性對照標本。

1.2操作方法

1.2.1.1將235份血清用生理鹽水按1：30稀釋，加入標本后立即加入酶結合物（使標本于酶結合物同步加入），37℃水浴30min，洗板，加入顯色劑，加入終止液，酶標儀比色，213份為陰性（標本A450nm>2.0為162份，標本A450nm>臨界值至2.0為51份）。

1.2.1.2將213份陰性血清用生理鹽水按1：30稀釋，另準備試劑盒中抗-HBc，抗-HBe陰性、陽性對照標本，平行做60孔，10孔一組分為A、B、C、D、E、F組，A組加入抗-HBc，抗-HBe陰性對照及標本后立即（0分鐘）加入酶結合物，以此類推于5（B組），10（C組），15（D組）20（E組），30（F組）分鐘加入酶結合物完成其他標本、陽性、陰性對照、及質控品，其他操作按標準操作說明書進行，分別獲得各自情況下的比色結果。臨介值（C.O）=陰性對照平均A值×0.5。

1.3統(tǒng)計學方法 采用F檢驗，樣品率采用x2檢驗，統(tǒng)計采用Excel軟件。

2 結果

2.1抗-HBc，抗-HBe抗體檢測間隔加酶結合物時間對結果的影響 見表1、表2。從表1可見，加入標本后5min，再加入酶結合物，即有24份A450nm值>臨界值0.1～0.35的標本出現(xiàn)假陽性，表現(xiàn)為測定標本A450nm值明顯下降至<臨界值0.7以內。隨著加樣后室溫放置時間的延長，假陽性明顯增多。放置時間≥20min時，假陽性顯著增加，約達到放置時間5min組的5倍，加樣后室溫放置30min，本試驗組的213份陰性標本僅剩96份仍為陰性結果。

從表2可見，加入標本后5分鐘，再加入酶結合物，即有14份A450nm值>臨界值0.1～0.35的標本出現(xiàn)假陽性，表現(xiàn)為測定標本A450nm值明顯下降至<臨界值0.7以內。隨著加樣后室溫放置時間的延長，假陽性明顯增多。放置時間≥20min時，假陽性顯著增加，約達到放置時間5min組的5倍，加樣后室溫放置30min，本試驗組的213份陰性標本僅剩110份仍為陰性結果。

3 討論

乙型肝炎病毒（HBV）屬嗜肝（DNA）病毒科（hepadnaviridae），基因組長約3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。乙型肝炎是危害嚴重的病毒性傳染病，廣泛流行于全世界，迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)無HBsAg陽性攜帶者地區(qū)。我國的乙肝病毒感染率約60%～70%；乙肝表面抗原攜帶率約占總人口的7.18%，以此計算，全國約1億人攜帶乙肝病毒，其中乙肝患者約3000萬。ELISA檢測抗-HBc，抗-HBe抗體的原理是采用基因工程重組表達的HBcAg、HBeAg包被固相反應板，加入標本的同時加入酶結合物，使待測標本中的HBcAb、HBeAb與酶結合物中的HBcAb、HBeAb公平競爭結合固相反應板上的HBcAg、HBeAg，形成\"抗體-抗原-抗體\"結構的免疫復合物。

臨床上檢測乙肝兩對半均采用手工加樣，日常工作中是存在標本加樣越多，加樣時間越長，加酶時間月晚，這樣勢必存在著先加入的血清較長時間與固相上的HBcAg、HBeAg結合，與酶結合物形成明顯的時間差，造成假陽性；其二，由于在制備工藝上存在至今尚未解決的問題，使純度受到影響，尤其是存在交叉反應、干擾物質的標本，在延時加入酶結合物情形，造成非特異性干擾，使假陽性增多。

加樣后多長時間再加入酶結合物就可出現(xiàn)假陽性？假陽性率多少？本次試驗證實，加樣后室溫放置5min，再加入酶結合物，就可出現(xiàn)7%～11%假陽性；加樣后室溫放置30min，再加入酶結合物，可出現(xiàn)48%～55%假陽性。一個熟練的檢驗工作者進行150個標本的稀釋和加樣約需26min，如果采用加完150個標本再加酶結合物的加樣方式，造成假陽性結果難以避免。我們建議： 采用加入血清后立即加入酶結合物，然后再加下一個血清的加樣方式，不要使用把每批次血清加完再加入酶結合物的加樣方式。 檢驗結果在臨界值范圍A450nm值<0.3的標本必須進行復檢。 陽性標本用金標復檢，避免標本加錯。④對兩對半少見模式嚴格復檢。

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