摘要：目的 觀察辛伐他汀對大鼠脂肪源性干細胞的增殖及骨代謝的影響。方法 采用膠原酶消化的方法，從大鼠腹股溝脂肪中分離出脂肪干細胞，貼壁法篩選純化細胞并體外擴增。取第3代細胞，加入不同濃度的辛伐他?。?μm，0.01μm，0.1μm，1μm，10μm，100μm）CCK-8檢測各組的細胞增殖能力；使用RT-PCR檢測相關骨向分化基因的表達；茜素紅染色評價成骨誘導礦化的效果。結(jié)果 濃度低于1μm的辛伐他汀各組可促進脂肪源性干細胞增殖（P<0.05），高于此濃度會對細胞產(chǎn)生劑量依賴性的抑制作用；辛伐他汀濃度低于1μm的各組對脂肪源性干細胞成骨誘導相關基因的表達以及成骨礦化誘導有顯著的促進作用（P<0.05）。結(jié)論 一定濃度的辛伐他汀對大鼠脂肪源性干細胞的增殖和成骨分化有促進作用。

關鍵詞：辛伐他?。恢驹葱愿杉毎?；成骨誘導；增殖

辛伐他汀誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導分化及增殖的作用已屢見報道，但其對脂肪源性干細胞的成骨分化是否有誘導作用還有待研究。本實驗擬使用不同濃度梯度的辛伐他汀誘導大鼠脂肪源性干細胞成骨分化，旨在從體外細胞水平探索辛伐他汀對大鼠脂肪源性干細胞成骨誘導的最佳劑量。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1主要試劑 辛伐他?。硸|），I型膠原酶（Sigma），CCK-8（碧云天），RNAiso Plus（TAKARA）， PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA）， SYBR〇R Premix Ex TaqTM II （TAKARA），茜素紅S（Sigma），引物合成（上海introvigen），常規(guī)細胞培養(yǎng)器械。

1.1.2實驗動物 清潔級雄性SD大鼠12只，4～6周齡，體重100～180g。常規(guī)手術(shù)器材，無菌手術(shù)間，動物手術(shù)臺。

1.2方法

1.2.1 ADSCs的分離與純化培養(yǎng) 將大鼠用0.6%戊巴比妥鈉（0.5ml/100g）腹腔注射麻醉，雙側(cè)腹股溝去毛，消毒鋪單，取腹股溝直切口，分離皮下脂肪，操作注意無菌原則。將約1.2g脂肪移入超凈臺，含2%雙抗的PBS漂洗5遍，剔除結(jié)締組織和血管，然后剪碎。PBS沖洗2編后，加入3倍體積的0.15%I型膠原酶，37℃恒溫震蕩（250rpm）消化60min，待消化液渾濁。白色液性脂肪漂浮于表層，殘余組織沉淀于底層。加入等體積的含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻，1500r/min，離心10min，棄去上層殘余脂肪及上清。用含10%FBS+1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)基混懸細胞，70μm篩網(wǎng)過濾[1]。調(diào)整細胞濃度至1×105/ML，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。48h后換液，清楚漂浮細胞，之后換液1次/3d。7～9d后細胞可生長至80%～90%融合，之后1：3傳代。從第二代開始，消化后按每1×106個細胞每支凍存管的量凍存細胞，長期保存。

1.2.2辛伐他汀對ADSCs增殖的影響 取第3代細胞，以每孔1500個細胞接種于96孔板中，每孔100ul，待細胞貼壁生長后第2d，以不同濃度的辛伐他汀（0μm，0.01μm，0.1μm，1μm，10μm，100μm）加入常規(guī)培養(yǎng)基中，（每組n=5孔），分別于培養(yǎng)0h、24 h、48h、72h后每孔加入10ul cck-8，37℃避光孵育2h，終止培養(yǎng)，置酶標儀上測定波長450 nm處的吸光度值。實驗重復3次。

1.2.3細胞總RNA的提取和熒光定量PCR檢測ADSCs中成骨分化相關因子的表達 根據(jù)增殖實驗的結(jié)果，減少了對增殖有抑制作用的高濃度辛伐他汀組，共設置5組：陽性對照組和陰性對照組，以及不同濃度的辛伐他汀組（0.01μm，0.1μm，1μm）。陽性對照組除加入常規(guī)培養(yǎng)基（低糖DMEM+10%FBS+1%雙抗）外，還加入礦化誘導劑（100nM地塞米松+0.2nM維生素C+10mMβ-甘油磷酸鈉），陰性對照組只加入常規(guī)培養(yǎng)基。細胞換液1次/d，培養(yǎng)14d后提取細胞總RNA，用微量核酸儀測定其濃度和純度。取總RNA 600ng進行cDNA的合成，引物見表1。PCR擴增反應條件為：預變性95℃ 30s，94℃變性5s.退火60℃ 34s，40個循環(huán)，95℃終末延伸15s，59℃ 1min，95℃ 15s。反應體系為20ul。

1.2.4茜素紅染色 按2×104cells/孔的細胞密度接種第三代ADSCs于24孔板中，每組3孔，共5組。分組同PCR檢測。誘導14d后，洗去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10min，去除固定液，漂洗后加入茜素紅染色液37℃染色20min，洗去殘留染色液，鏡下觀察。然后再利用等量5%SDS-鹽酸溶液洗脫茜素紅，混勻后取100ul上酶標儀讀取OD值，統(tǒng)計分析結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學分析 結(jié)果以均數(shù)±標準差（x±s）表示，并采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計。使用單因素方差分析進行分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的形態(tài)學觀察 接種ADSCs原代細胞24h后，可見細胞貼壁，胞體較小，星形，單核，有漂浮的脂肪液滴。48h后貼壁細胞數(shù)量增多，少數(shù)細胞呈集落生長，細胞呈梭形、形態(tài)不規(guī)則，細胞體積進一步增大。72h后細胞呈典型的成纖維細胞樣生長，部分聚集成團。培養(yǎng)7d后，梭形細胞生長速度加快，細胞密度接近80%，此時可傳代。見圖1。

圖1 ADSCs傳代第3代

2.2不同濃度辛伐他汀對ADSCs增殖的影響 CCK-8檢測表明，0.01μm/L組、0.1μm/L組的ADSCs的增殖活性明顯增加，0.01μm/L組的細胞增殖能力最強。但當繼續(xù)增加辛伐他汀濃度時，其促進ADSCs的能力呈下降趨勢，其中1μm/L組與對照組相比，ADSCs的增殖能力無明顯差異，10μm/L組對ADCSs的增殖有明顯的抑制作用。各組ADSCs的增殖曲線見圖2。

圖2 CCK-8檢測不同濃度辛伐他汀刺激下ADSCs的增殖曲線

2.3 ADSCs在不同濃度辛伐他汀誘導下的成骨相關基因表達變化 為了檢測ADSCs的骨形成能力，我們檢測了多個具有代表性的成骨相關基因，見圖3。根據(jù)CCK-8的實驗結(jié)果提示10μm/L濃度的辛伐他汀對ADSCs的增殖有明顯的抑制作用，因此我們調(diào)整了分組，在本部分實驗中去除了10μm/L濃度組，陽性對照組中加入成骨誘導培養(yǎng)基。我們發(fā)現(xiàn)0.01μm組、0.1μm組、1μm組均能上調(diào)成骨相關基因的表達。

圖3 成骨相關基因的表達情況

2.4辛伐他汀對ADSCs分化的影響 不同濃度辛伐他汀對大鼠脂肪干細胞的礦化誘導作用如圖3所示。0.01μm、0.1μm、1μm和陽性對照組與陰性對照組相比其茜素紅陽性的礦化結(jié)節(jié)更高（P<0.05），0.01μm組比陽性對照組高（P<0.05）。0.01μm濃度的辛伐他汀對ADCSs的成骨礦化誘導有顯著的促進作用。見圖4、圖5。

圖4 誘導14d后茜素紅染色。圖為0.01μm組染色結(jié)果。

圖5 茜素紅染色定量分析

注：*：P<0.05 各組與陰性對照組比較；#：P<0.05 0.01μm與陽性對照組比較

3 討論

近年來，隨著干細胞研究的發(fā)展，脂肪源性干細胞越來越多的受到人們的關注。自從Zuk第一次從脂肪組織中提取出具有與骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marow mesenchymal stem cels，BMSCs）相似的多向分化性能的成體干細胞，并命名為脂肪組織提取物（processed lipoaspirate cells，PLA） 開始[2]，對脂肪干細胞的研究就從未停止過。脂肪組織來源于中胚層，在各種組織中廣泛，皮下尤其豐富，所以脂肪組織分離ADSCs相對簡單。由于其中胚層來源的屬性，理論上ADSCs具有跨胚層向其他胚層細胞多向分化的潛能[3]。ADSCs組織相容性好，能在維持良好的生物相容性同時不引起免疫排斥反應。芬蘭口腔外科醫(yī)師將一名患者的自體脂肪干細胞異位誘導成骨修復上頜骨大面積骨缺損，并獲得了良好的療效[4]。有研究把ADSCs注入小鼠皮下觀察其致瘤作用，在1年時間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)成瘤[5]，但其遠期的生物安全性還有待進一步研究。

他汀類藥物除具有調(diào)脂功能以外，還具有改善血管內(nèi)皮功能、減輕血管炎癥反應等作用[6，7]。他汀類藥物特別是辛伐他汀，對骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化有促進作用。對多種成骨細胞株的體外成骨也有一定的促進作用。那么對于脂肪源性干細胞，辛伐他汀是否能夠發(fā)揮類似的促成骨作用？為了回答這個問題，我們通過體外實驗確定不同濃度辛伐他汀對大鼠脂肪干細胞增殖能力的影響，然后確定不同濃度辛伐他汀對大鼠脂肪干細胞成骨分化能力的影響。本實驗中CCK-8檢測結(jié)果提示10μm濃度的辛伐他汀對大鼠脂肪干細胞的增殖表現(xiàn)出明顯的抑制作用，在0.01μm和0.1μm濃度辛伐他汀對ADSCs表現(xiàn)出一定的促增殖作用。在BMMSCs的相關研究中提示高于1μm濃度的他汀類藥物對BMMSCs將表現(xiàn)出細胞毒性，從而引起部分BMMSCs死亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀對脂肪干細胞增殖的影響與BMMSCs類似。我們研究發(fā)現(xiàn)0.01μm、0.1μm、1μm辛伐他汀能夠在不抑制脂肪源性干細胞增殖的同時不同程度的上調(diào)OC、BMP-2、Smad1、RUNX2、VEGFa等成骨相關基因，誘導成骨分化及礦化。我們通過體外檢測不同濃度辛伐他汀對脂肪源性干細胞的增殖和成骨定向誘導分化的影響，發(fā)現(xiàn)脂肪源性干細胞在成骨誘導分化潛能上與骨髓間充質(zhì)干細胞類似，辛伐他汀對干細胞成骨誘導分化的作用可能具有普遍性而非組織特異性，其具體的作用位點和下游信號通路是否與骨髓間充質(zhì)干細胞類似還有待進一步確定。

但是在辛伐他汀口服及靜脈注射等多種給藥途徑的動物實驗中其對于骨髓源性干細胞并不能展現(xiàn)出與體外實驗相類似的效應，具體原因與可能與辛伐他汀的體內(nèi)代謝降解或組織分布有關。在體內(nèi)，辛伐他汀對脂肪源性干細胞的成骨定向誘導分化是否具有作用，以及其具體的有效濃度、劑量和具體給藥途徑，我們還需進行更深入的實驗。

有相關研究嘗試將辛伐他汀用于輔助糖尿病干細胞移植等其他非骨器官的干細胞移植，因本研究證實辛伐他汀的成骨誘導作用，因此對于這類研究的前景我們持保守態(tài)度。有研究認為他汀類藥物能夠通過激活成骨細胞的BMP-2啟動子，從而上調(diào)BMP-2基因的表達，進而發(fā)揮增強骨修復的生物學功能，提示辛伐他汀可能通過Ras/Smad/Erk/BMP-2的信號通路，調(diào)節(jié)成骨分化。局部應用辛伐他汀能夠提高局部BMP-2和VEGF的基因表達，這與我們的研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究為辛伐他汀在脂肪干細胞移植治療成骨障礙方面提供了實驗依據(jù)。由于辛伐他汀的安全性、易獲取性、促成骨效果明確等優(yōu)點，其在高效促進組織工程化骨的實際應用方面將發(fā)揮更為深遠的作用。

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編輯/哈濤