摘要： 目的： 檢測不同時間點AMD3100對人肝癌HepG2細胞增殖及其與甲胎蛋白（alpha fetoprotein， AFP）表達的影響并探討其意義。方法： MTT 法檢測不同時間AMD3100對人肝癌細胞HepG2增殖的影響； Western blott分析不同時間點AMD3100對AFP表達的影響；結果： AMD3100對人肝癌HepG2細胞的抑制率在36h、48h、72h分別為35.2%、44.3%和56.3%，P<0.05；HepG2細胞AFP的表達減少，在36h、48h有顯著性差異。這兩方面的作用有時間依賴性；結論： AMD3100對HepG2細胞的增殖有抑制作用呈時間依賴性，這種抑制作用與抑制CXCR4信號軸有關，還可能與AFP的表達有關。

關鍵詞： AMD3100；甲胎蛋白；肝癌細胞；癌細胞增殖；CXCR4

【中圖分類號】R749.053【文獻標識碼】B【文章編號】1672-8602（2014）07-0152-02

基金項目： 國家自然科學基金項目（30960153）；2013年海南省教育廳重點項目（Hjkj2013-27）

AMD3100是趨化因子受體CXCR4（ CXC chemokine receptor 4，CXCR4）特異性阻斷劑，是一種小分子非肽類抑制劑，是橋聯 1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷，它在治療腫瘤、HIV 感染、炎性疾病和干細胞動員中具有很強的應用潛力[1]。AFP是早期診斷肝細胞癌的特異性標志物，具有促進人肝癌細胞的增殖作用[2，3]。本研究應用AMD3100作用于人肝癌HepG2細胞，觀察其在不同時間點對HepG2細胞生長的影響及其與AFP表達的關系。

1 材料與方法

1.1實驗材料

人肝癌細胞株HepG2（北京大學醫(yī)學部提供），兔抗人AFP抗體， CXCR4抗體，β-actin 抗體，辣根標記的羊抗兔IgG均購買于Stanta Cruz（America）公司；AMD3100（Sigma，America），DMEM高糖培養(yǎng)基，MTT（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide），96、6孔板均購自美國Gibco公司。優(yōu)質胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；蛋白質印記marker（北京全式金生物技術有限公司）；硝酸纖維素膜（BioRad，America）。

1.2方法

1.2.1 MTT法檢測不同時間AMD3100對細胞增殖的影響

用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)HepG2細胞，分別以合適的密度接種于96孔板（12h組1.0×105個/ml；24h組及36h組5.0×104個/ml；48h組3.0×104個/ml；72h組2.0×104個/ml），100μl/孔，每組設6個平行孔。培養(yǎng)24h后，更換新的培養(yǎng)液，100μl/孔。對照組不處理，加藥組加入AMD3100至終濃度為1.5μg/ml，對照組加入與加藥組同體積的H2O（因AMD3100溶于水）。分別在細胞培養(yǎng)12h，24h，36h，48h，72h后，每孔加入20μlMTT，37℃孵育4h。去掉所有的液體，加入100μl/孔二甲基亞砜，微量振蕩儀振蕩10min，自動酶標儀（Bio-TEK Instruments.Inc）在490nm波長測吸光值。細胞增殖抑制率=（對照組OD-實驗組OD）/ 對照組OD。

1.2.2 Western blot檢測不同時間點AMD3100對AFP表達的影響。

將HepG2細胞按合適的密度（12h組1.0×105個/ml；24h組及36h組5.0×104個/ml；48h組3.0×104個/ml），接種于6孔板中，每組設3個重復平行孔，加入到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，24h后，對照組不處理，加藥組分別加入AMD3100至終濃度為1.5μg /ml培養(yǎng)細胞。分別在細胞培養(yǎng)0h，12h，24h，36h，48h后，收取細胞，提取蛋白，定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳，再把蛋白質從聚丙烯酰胺凝膠轉移到硝酸纖維素（NC）膜，進行抗原-抗體結合反應，用化學發(fā)光儀（LAS3000）（FUJI，Japan）檢測細胞AFP表達的變化，具體操作按文獻[6]方法進行。

1.2.6 統計學處理 應用統計學軟件SPSS11.5對數據進行t-test，P﹤0.05具有統計學意義，P﹤0.01具有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 AMD3100對HepG2細胞增殖的抑制作用

MTT結果表明，在12h，24h，AMD3100對HepG2細胞的增殖沒有顯著性影響，在36h，48h和72h，AMD3100對HepG2細胞增殖抑制率分別為 35.2%，44.3%和56.3%，和對組比較有顯著性差異，呈時間依賴性，P<0.01（見圖1）。

圖1.不同的時間點AMD3100對HepG2細胞增殖的抑制作用

AMD3100（1.5 g/ml）處理HepG2細胞，分別在12h，24h，36h，48h，72h，用MTT法檢測并計算其抑制率。和對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 不同用藥時間點AMD3100對HepG2細胞AFP表達的影響

Western blot結果表明，用濃度為1.5 g/ml的AMD3100處理HepG2細胞，在12h，24h，HepG2細胞表達AFP沒有顯著性變化，在36h、48h，HepG2細胞表達AFP顯著減少，呈時間依賴性。