摘要：目的 研究南極磷蝦胰蛋白酶基因的全序列，為低溫酶的基因工程制備建立基礎(chǔ)。方法 以南極磷蝦基因組DNA為模板，利用特異性的巢式引物和隨機(jī)引物，通過(guò)交錯(cuò)式熱不對(duì)稱PCR （Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction， TAIL-PCR） 克隆南極磷蝦胰蛋白酶基因序列，并進(jìn)行序列分析。結(jié)果 測(cè)序結(jié)果表明，南極磷蝦胰蛋白酶基因序列全長(zhǎng)961bp，其中含有開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為798bp，編碼266個(gè)氨基酸。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)成功克隆了南極磷蝦胰蛋白酶基因，為進(jìn)一步了解該酶的結(jié)構(gòu)、功能和基因工程制備奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：南極磷蝦；TAIL-PCR；胰蛋白酶；基因

胰蛋白酶是動(dòng)物消化系統(tǒng)中主要的一種堿性蛋白水解酶，屬絲氨酸蛋白酶家族，能專一性地水解肽鏈中賴氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽鍵。南極磷蝦因其獨(dú)特的生活環(huán)境，體內(nèi)的胰蛋白酶具低溫高效性，有研究表明，南極磷蝦胰蛋白酶在37℃和1～3℃時(shí)的活性分別是牛胰蛋白酶活性的12倍和60倍[1]。深入研究該酶對(duì)適冷性酶酶學(xué)性質(zhì)的探究、蛋白質(zhì)工程體系的完善具有極高的價(jià)值。目前獲得南極磷蝦胰蛋白酶的方法主要是組織提取，這不僅步驟繁瑣而且成本高昂。本文旨在克隆南極磷蝦胰蛋白酶基因，為進(jìn)一步在工程菌中表達(dá)以大量獲得南極磷蝦低溫酶奠定基礎(chǔ)。

交錯(cuò)式熱不對(duì)稱PCR （Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction， TAIL-PCR）是一種快速有效擴(kuò)增已知DNA序列側(cè)翼未知序列的方法[2-3]，由Liu和Whittier[4]首次報(bào)道該技術(shù)。目前許多基因的克隆都是通過(guò)這個(gè)方法獲得，馬春驥等[5]用TAIL-PCR成功克隆了綿羊肺炎支原體Y98株的未知基因Hsp70 （DnaK） ，張偉濤等[6]利用TAIL-PCR克隆了一種耐鹽基因。

1 材料與方法

1.1材料 南極磷蝦冰凍樣本2012年取自南冰洋水域48.1區(qū)，限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅤ、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、Genome Walking Kit購(gòu)自Takala公司，pEASY-Blunt Cloning kit、pEASY-T1 Cloning Kit購(gòu)自全式金公司，TIANamp Marine Animals DNA Kit購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，DNA Engine Dyad PCR儀產(chǎn)自美國(guó)Bio-RAD公司，PCR引物由北京華大基因公司合成。

1.2南極磷蝦基因組DNA的提取 南極磷蝦為本課題組參加南極科考任務(wù)所取樣品，取其尾節(jié)肌肉組織提取DNA，按照動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因組DNA提取。

1.3南極磷蝦胰蛋白酶基因保守片段的克隆 根據(jù)文獻(xiàn)及GenBank中已報(bào)道同源性較高的幾種甲殼動(dòng)物胰蛋白酶的氨基酸序列，得到兩條簡(jiǎn)并引物。上游引物：CCTTACCAGCTCAGCTTCCAG；下游引物：TGCGGTGTTAGTCATAATCC。使用上述簡(jiǎn)并引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：template DNA 200ng，primer1 10pmol，primer2 10pmol，PrimeSTAR Max Premix （2X） 25μl，Sterilized distilled water to 50μl。反應(yīng)條件：98℃ 10s，55℃ 5s，72℃ 5s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min，擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，將PCR產(chǎn)物用QuickGel Extraction Kit回收后克隆至pEASY-Blunt Cloning Vector，經(jīng)酶切鑒定重組質(zhì)粒測(cè)序。

1.4利用TAIL-PCR獲得基因5' 端序列 根據(jù)克隆得到的基因序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)3條序列特異性的巢式引物，SP1： GAGGAATGGCCTGGA

CGAAGTCATT；SP2：CTCATGTTGGATGATCTTGGACAGG；SP3： AACACAATG

TCCAGCGCAGATGGC。進(jìn)行TAIL-PCR時(shí)，分別用AP1 Primer和AP2 Primer進(jìn)行反應(yīng)，以AP2組為例，用上述提取的基因組DNA作為模板，以AP2 Primer作為上游引物，以SP1作為下游引物，進(jìn)行1st PCR反應(yīng)。2st PCR 反應(yīng)將1st PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋1000倍，取1μl作為2st PCR 反應(yīng)的模板，以AP2 Primer為上游引物，以SP2作為下游引物。3st PCR 反應(yīng)將2st PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋1000倍，取1μl作為3st PCR 反應(yīng)的模板，以AP2 Primer為上游引物，以SP3作為下游引物。三次反應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別參照Genome Walking Kit試劑盒。反應(yīng)完成后，取3st PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，將回收產(chǎn)物與pEASY-T1 Cloning 載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1-T1，采用藍(lán)白斑篩選，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證后測(cè)序。

1.5克隆南極磷蝦胰蛋白酶基因 利用已獲得的南極磷蝦胰蛋白酶基因5' 端和3' 端序列設(shè)計(jì)引物，基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.3。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，將PCR產(chǎn)物用QuickGel Extraction Kit回收后克隆至pEASY-Blunt Cloning Vector，經(jīng)酶切鑒定重組質(zhì)粒，測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 南極磷蝦胰蛋白酶基因5' 端序列 以基因組DNA為模板，利用引物SP1、SP2、SP3與Genome Walking Kit提供的隨機(jī)引物AP1、AP2進(jìn)行三輪PCR擴(kuò)增，僅用隨機(jī)引物AP2得到預(yù)期的陽(yáng)性結(jié)果，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。將圖1第二泳道長(zhǎng)度接近250bp的片段克隆至pEASY-T1 Cloning載體，酶切驗(yàn)證正確后測(cè)序得到一段長(zhǎng)為257bp的序列，經(jīng)分析，確定這257bp含胰蛋白酶5' 端及上游28bp的序列。

2.2南極磷蝦胰蛋白酶基因序列分析 以基因組DNA為模板，利用基因5' 和3' 端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。將圖2所得的PCR產(chǎn)物回收后，克隆至pEASY-Blunt Cloning載體，經(jīng)酶切驗(yàn)證后，測(cè)序，測(cè)得其為一961bp的序列，用\"GT-AG法則\"[7]分析發(fā)現(xiàn)該片段第267-429位置是內(nèi)含子，長(zhǎng)度為163bp；同時(shí)具有兩個(gè)完整的外顯子區(qū)1-266和430-961。利用DNATools軟件進(jìn)行分析后，推斷胰蛋白酶含有266個(gè)氨基酸。經(jīng)Clustal X軟件和NCBI Genebank軟件將推測(cè)得到的氨基酸序列與已報(bào)道的胰蛋白酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有較高的相似度。其與凡納濱對(duì)蝦胰蛋白酶有較高的相似度（Identities=82%），與日本囊對(duì)蝦、中國(guó)對(duì)蝦的相似度都達(dá)到了81%、81%。基因ORF見(jiàn)圖3。

3 討論

胰蛋白酶的研究歷經(jīng)了粗酶提取、分離純化、分子結(jié)構(gòu)、蛋白亞型研究以及基因的研究[10]，每個(gè)階段隨著實(shí)驗(yàn)的推進(jìn)和分析數(shù)據(jù)的增加都帶來(lái)新理念的更新和研究領(lǐng)域的擴(kuò)展，現(xiàn)階段甲殼動(dòng)物胰蛋白酶的研究較少。利用信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件SingnalP推斷南極磷蝦胰蛋白酶的信號(hào)肽為1-14aa，前體蛋白為1-29aa。和其它甲殼動(dòng)物的胰蛋白酶序列一樣，南極磷蝦胰蛋白酶的成熟肽的序列同樣是從Ile-Val-Gly-Gly開(kāi)始，含有所有絲氨酸蛋白酶中都保守的活性三聯(lián)體His74、Asp125、Ser225。

本實(shí)驗(yàn)成功克隆了南極磷蝦胰蛋白酶基因，并合理推斷相應(yīng)的氨基酸序列，對(duì)基因的結(jié)構(gòu)研究、cDNA的獲得及胰蛋白酶層面的探索具有十分積極的意義，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為下一步基因表達(dá)低溫胰蛋白酶提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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[5]馬春驥，李敏，等. 綿羊肺炎支原體 Y98 株未知基因 Hsp70 （DnaK） 的克隆[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011， 31（12）： 1733-1737.

[6]張偉濤，程國(guó)軍，周俊初. 利用TAIL-PCR克隆耐鹽基因及其分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2010， （11）： 166-170， 176.

[7]吳志強(qiáng). 太平洋磷蝦 （Euphausia Pacifica Hansen） 胰蛋白酶樣酶酶學(xué)性質(zhì)及基因片段研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2007：2-164.

編輯/王敏