摘要：目的 探尋鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法并進(jìn)行鑒定。方法 體外誘導(dǎo)鼠骨髓細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞，觀察形態(tài)學(xué)變化，分析細(xì)胞特異性標(biāo)志物，同時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)同種異體混合淋巴細(xì)胞發(fā)生增值能力的檢測(cè)。結(jié)果 培養(yǎng)216 h后樹突狀細(xì)胞高倍鏡下可見典型的樹突樣特點(diǎn)。成熟樹突樣細(xì)胞cd11c、mchII、cd86表達(dá)水平較高，可誘導(dǎo)同種異體混合淋巴細(xì)胞發(fā)生增值。結(jié)論 本方法為研究樹突狀細(xì)胞的功能以及運(yùn)用提供材料。

關(guān)鍵詞：樹突狀細(xì)胞；培養(yǎng)；鑒定

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是目前所知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，是由加拿大學(xué)者Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)的，因其成熟時(shí)伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。它能高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原，未成熟DC具有較強(qiáng)的遷移能力，成熟DC能有效激活初始型T細(xì)胞，處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。本研究從小鼠骨髓中誘導(dǎo)培養(yǎng)出樹突狀細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行分析鑒定，為優(yōu)化DC的體外培養(yǎng)方法進(jìn)行積極探索，從而為進(jìn)一步研究其性能奠定了基礎(chǔ)[1]。

1資料與方法

1.1一般資料 雄性健康6～8 w齡balb/c小鼠、KM小鼠，購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[2]。

1.2主要試劑 重組小鼠白細(xì)胞介素4（rmIL-4）和重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rmGM-CSF）（購自日本MBL公司）。脂多糖（LPS）（購自SANTA公司），熒光抗體PE-Cy5 anti-mouse CD11c、PE anti-mouse MHCII、PE anti-mouse CD86、CD80、（均購置美國Abcam公司）。RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）（購自美國RD公司）

1.3方法

1.3.1鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將細(xì)胞因子rmGM-CSF（10 ng/mL）和rmIL-4（10 ng/mL）與FBS、 RPMI1640培養(yǎng)液充分混合，形成全營養(yǎng)培養(yǎng)液，于4℃環(huán)境保存。于開始收集細(xì)胞前30 min取出后復(fù)溫于室溫。溺死balb/c小鼠，75%醫(yī)用酒精消毒5～10 min，無菌生物柜中分離出脛骨和股骨，將肌肉除去，剪開骨兩端，用注射器針頭沖洗出骨髓至培養(yǎng)皿，用300目篩網(wǎng)過濾骨髓組織懸液，將過濾液倒入離心管中。事先準(zhǔn)備小鼠淋巴細(xì)胞分離液，小心將骨髓組織懸液緩慢加入分離液表層（比例為2∶1）。高速離心4000轉(zhuǎn)15 min后，管內(nèi)液面出現(xiàn)3個(gè)不同層次，將中層的白膜層液體收集，于緩沖液沖洗，離心2000轉(zhuǎn)，15 min，再反復(fù)沖洗離心兩次。用細(xì)胞計(jì)數(shù)器、全營養(yǎng)培養(yǎng)液將末次離心后懸液調(diào)細(xì)胞濃度1～3×106/mL，并接種于50 mL培養(yǎng)瓶，置5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中。于第72 h，加入含rmGM-CSF（10 ng/mL）和rmIL-4（10 ng/mL）的完全培養(yǎng)液3 mL；于第120 h，再次加入上述濃度細(xì)胞因子的完全培養(yǎng)液3 mL，第168 h時(shí)半量換液，離心，加入脂多糖（1 μg/mL），至第216 h，收集所有的懸浮于培養(yǎng)瓶液面細(xì)胞，并吹打瓶壁，收集，此即為本次試驗(yàn)所用的鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞（BMDC）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)日用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，記錄其生長過程和形態(tài)演變。

1.3.2骨髓來源樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志物測(cè)定 將培養(yǎng)至第216 h的樹突狀細(xì)胞，以細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105/mL，加入2 μL CD80、CD86、mhcII單抗和CD11c單抗。設(shè)立對(duì)照組。30 min反應(yīng)后于流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.3.3同種異體淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR） 溺死KM小鼠，將其脾臟分離，碾磨，混合RPMI 1640培養(yǎng)液，過300目篩網(wǎng)后收集細(xì)胞懸液。以前文所述分離淋巴細(xì)胞方法分離出淋巴細(xì)胞，于5%CO2，37℃的環(huán)境中4 h，可得到試驗(yàn)所用反應(yīng)細(xì)胞。加入絲裂霉素（80 μg/mL）500μl處理樹突狀細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，調(diào)整混合淋巴細(xì)胞濃度為3×106/mL，加入48孔培養(yǎng)皿，各200 μL/孔，按未成熟樹突狀細(xì)胞、成熟樹突狀細(xì)胞、空白對(duì)照分成三組，分別以1∶5、1∶10、1∶20、1∶40四種刺激細(xì)胞濃度與反應(yīng)細(xì)胞比例加入48孔板。設(shè)置復(fù)孔，終體積為400 μL。于5%CO2，37℃環(huán)境混合培養(yǎng)120 h。在混合培養(yǎng)結(jié)束前24 h，加入3H-TdR標(biāo)記，并檢測(cè)CPM值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1樹突狀細(xì)胞的生長 高倍鏡下觀察，8 h后可見細(xì)胞小而圓形，懸浮，分布均勻，30 h后可見一部分細(xì)胞貼瓶壁，一部分懸浮，見圖1，第48 h出現(xiàn)少許懸浮細(xì)胞，將其吸取后可看見點(diǎn)狀細(xì)胞集落；第72 h可見數(shù)量較多細(xì)胞團(tuán)，見圖2，第120 h后，細(xì)胞多呈半懸浮狀態(tài)，體積較前明顯增大并聚集，細(xì)胞外圍可見明顯的樹突樣突起，可見分叉，見圖3；第168 h，細(xì)胞基本從瓶壁脫離、成簇懸浮，體積較前更大，樹突樣突起更加明顯，且較粗大，見圖4。

圖1 第30 h高倍鏡下影像（×200） 圖2 第72 h高倍鏡下影像（×400）

圖3 第120 h高倍鏡下影像（×400） 圖4 第168 h高倍鏡下影像（×400）

2.2樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測(cè) 收集經(jīng)rmIL-4和rmGM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)第120 h、第168 h和添加脂多糖后第216 h后的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定第120 h：低表達(dá)CD11c（36.22%），低表達(dá)mchII（57.41%）和CD86（40.24%），為未成熟樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志物特點(diǎn)；第168 h：高表達(dá)CD11c（60.11%），低表達(dá)mhcII（71.08%）和CD86（72.33%），為較成熟樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志物特點(diǎn)；而經(jīng)脂多糖刺激后的樹突狀細(xì)胞高表達(dá)CD11c（84.68%），且高表達(dá)mchII（95.97%）和CD86（96.10%），顯著高于未成熟樹突狀細(xì)胞，為成熟樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志物特點(diǎn)。

2.3 MLR能力 未成熟樹突狀細(xì)胞組和成熟樹突狀細(xì)胞組均能誘導(dǎo)同種異體混合淋巴細(xì)胞發(fā)生增值（P<0.05），其能力與樹突狀細(xì)胞濃度為明顯正比，見圖5。

圖 5 鼠BMDC刺激同種異體混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

3討論

樹突狀細(xì)胞在組織中廣泛分布，但提取困難且數(shù)量少，所以尋求一種方法體外培養(yǎng)并得到一定數(shù)量的有功能的樹突狀細(xì)胞就很有必要[3]。鑒定一種細(xì)胞是否為樹突狀細(xì)胞，現(xiàn)通用鏡下形態(tài)、表現(xiàn)特異性標(biāo)志和MLR水平來判 斷[4]，而且其還應(yīng)該表達(dá)CD33、CD80、CD86等標(biāo)志物。

現(xiàn)階段常用培養(yǎng)并提純樹突狀細(xì)胞方法主要有：①磁珠篩選：即依照樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行篩選，但實(shí)際上樹突狀細(xì)胞并無表面特異性標(biāo)志，故篩選方法、流程復(fù)雜，且花費(fèi)高昂。最后得出的樹突狀細(xì)胞數(shù)量亦不盡人意。②體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增：通過本研究方法得出的樹突狀細(xì)胞，在形態(tài)上可見明顯的樹突樣特點(diǎn)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示細(xì)胞表達(dá)較高水平的表面分子；而MLR則更進(jìn)一步說明其有刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力。

綜上所述，此是目前階段較好的培養(yǎng)、擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法。

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編輯/肖慧