摘要：目的 通過對非小細(xì)胞肺癌組織中GPC5和TNFR10的表達(dá)關(guān)系及意義，旨在為NSCLC的診斷、惡性程度的判定及治療提供有效的理論依據(jù)。方法 取我院2011年1月～2012年6月手術(shù)切除的NSCLC標(biāo)本96例，采用RT-PCR法檢測GPC5和TNFR10的mRNA水平。結(jié)果 實驗中內(nèi)參GADPH在各檢測樣本中均持續(xù)陽性表達(dá)，提示樣本質(zhì)量良好。結(jié)論 提高了實驗數(shù)據(jù)的可靠性，為臨床選擇更合適的治療方案提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：磷脂酰肌醇蛋白聚糖5；腫瘤壞死因子受體10；肺腺癌

1資料與方法

1.1一般資料 取我院2011年1月～2012年6月手術(shù)切除的NSCLC標(biāo)本96例，其中男56例，女40例；年齡在24～73歲，>60歲58例，<38歲30例；腺癌61例，非腺癌35例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者58例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例；有吸煙史37例，無吸煙史61例；高、中、低分化癌分別為19例、32例和45例；臨床分期：I期16例，Ⅱ期42例，Ⅲ期30例，Ⅳ期8例。所有病例術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療。另取18例手術(shù)切除的良性病變肺組織作為對照，全部標(biāo)本收集后立即于-80°C冰箱保存，全部標(biāo)本均有病理確診。

1.2引物的設(shè)計與合成 由大連寶生物公司設(shè)計合成，見表1。

1.3方法

1.3.1總RNA的提取及cDNA的合成 按Trizol裂解抽提法進(jìn)行總RNA的提取。通過測A260值檢測RNA濃度，測A260/280值檢測其純度。1%瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法合成cDNA存放-20℃冰箱備用。

1.3.2 RT-PCR擴(kuò)增 25ul體系 PCR reaction mixture12.5 uL，上、下游引物（10 pmol/uL）各1 uL，cDNA模板1 uL，ddH2O 25uL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃ 45 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，共30個循環(huán)；72℃終延伸5 min。

1.3.3數(shù)據(jù)收集處理和分析 統(tǒng)計結(jié)果用灰度值表示，以GADPH灰度值為參照，標(biāo)化計算各樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行半定量分析，從而獲得各目的基因的相對模板數(shù)，即：目的基因/GADPH。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，樣本均數(shù)的比較使用兩獨立樣本均數(shù)t檢驗，GPC5和TNFR10的表達(dá)關(guān)系用Pearson線形相關(guān)檢驗，P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1引物特異性 用2%瓊脂糖凝膠電泳分析比對PCR產(chǎn)物長度并經(jīng)測序確認(rèn)與各目的片段cDNA序列一致，見圖1、圖2。

圖1 GPC5瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 圖2 TNFR10瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 GPC5的表達(dá)比較 GPC5在NSCLC腺癌組織中平均表達(dá)水平低于肺良性病變組織（2.21±1.64 vs 3.12±1.82）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；非腺癌組織與肺良性病變組織表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；GPC5在非吸煙肺癌患者中的表達(dá)低于吸煙患者（1.52±1.11 vs 3.32±1.56）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 TNFR10的表達(dá)比較 TNFR10在NSCLC腺癌組織中平均表達(dá)水平低于肺良性病變組織（1.88±1.56 vs 4.79±2.47） 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002<0.01）；其表達(dá)水平與吸煙史及腫瘤類型無關(guān)（P均>0.05）。

2.4 GPC5和TNFR10的關(guān)系 在NSCLC組織中GPC5與TNFR10的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.741，P<0.001），見圖3，他們的表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤分化程度及臨床分期均無關(guān)（P均>0.05）。

圖3 GPC5與TNFR10的關(guān)系

3討論

本研究采用RT-PCR法檢測GPC5和TNFR10的mRNA水平，我們知道m(xù)RNA的大量存在提示表達(dá)的增加，對mRNA的檢測提高了實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，實驗中內(nèi)參GADPH在各檢測樣本中均持續(xù)陽性表達(dá)，提示樣本質(zhì)量良好，提高了實驗數(shù)據(jù)的可靠性。

GPC5基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個非煙民罹患肺癌的特定基因，約有1/3的非吸煙肺癌患者有此基因的變異[1-2]。對GPC5與吸煙的關(guān)系探討發(fā)現(xiàn)GPC5在非吸煙肺癌患者中的表達(dá)低于吸煙患者，提示GPC5表達(dá)的下調(diào)可能與患者是否吸煙有關(guān)。Landi等指出在肺腺癌中，從不吸煙的患者GPC5基因的缺失率遠(yuǎn)比吸煙者高[3]，提示GPC5表達(dá)的下調(diào)或缺失可能增加非吸煙患者罹患肺癌的機(jī)率，對GPC5基因的進(jìn)一步研究，將有可能闡明非吸煙患者罹患肺癌的相關(guān)機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1]盧旭東，朱曉蘭，陳成，等.CD40信號通過TNFRⅠ途徑抑制肺癌細(xì)胞增殖的研究[J].癌癥，2009，（01）：27-32.

[2]顧紅兵，李繼坤.Hedgehog信號通路與腫瘤的關(guān)系研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2011，（04）：808-811.

[3]Li Y， Sheu C C， Ye Y， et al. Genetic variants and risk of lung cancer in never smokers： a genome-wide association study[J].Lancet Oncol，2010，11（4）：321-330.

編輯/肖慧