[摘要] 目的 探討婦科不同組織快速冷凍切片的最佳冷凍時(shí)間。 方法 選取我院2014年1月1日～8月31日婦科手術(shù)快速冰凍標(biāo)本350例，觀察不同冷凍時(shí)間對組織制片效果及診斷結(jié)果的影響，并與石蠟切片做對照。 結(jié)果 350例快速冷凍組織“冷凍2 min左右”時(shí)能做出正確診斷的例數(shù)為332例，診斷百分率為94.9%，“加2 min后”能做出正確診斷的例數(shù)為329例，診斷百分率為94.0%?！凹? min后”能做出正確診斷的例數(shù)為236例，診斷百分率為67.4%。 結(jié)論 “冷凍2 min左右”和“加2 min后”是婦科快速冷凍組織切片的最佳時(shí)間。不同的組織種類由于各成分構(gòu)成比例不同，故實(shí)際工作中要根據(jù)組織的這種特性選擇冷凍時(shí)間以達(dá)到最佳制片效果。

[關(guān)鍵詞] 快速冷凍；最佳時(shí)間；病理切片；婦科手術(shù)

[中圖分類號] R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）36-0048-04

Exploration and experience of optimal quick frozen-section time for gynecological specimens

MA Banglei MI Fangyuan LI Fengshan GU Yun

Department of Pathology， Nanjing Maternity and Child Health Care Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210004，China

[Abstract] Objective To explore the best frozen time of different frozen sections of gynecological tissues. Methods A total of 350 quick frozen specimens of gynecologic operations were selected from Nanjing Maternity and Child Health Care Hospital Affiliated to Nanjing Medical University between Jan 1 2014 and Aug 31 2014. The influences of different frozen time on the quick frozen sections and pathologic diagnosis were observed，and compared with paraffin sections'. Results 350 cases fast frozen tissue \"freeze about 2 min\" could make a correct diagnosis 332 cases， the diagnosis of percentage was 94.9%， “after plus 2 min”could make a correct diagnosis 329 cases， the diagnosis of percentage was 94%；“after plus 2 min” could make a correct diagnosis 236 cases，the diagnosis of percentage was 67.4%. Conclusion “freeze about 2 min” and “after plus 2 min” is the best time for gynecologic rapid frozen section. Different tissue types due to the different proportion of components， so the actual work according to this characteristic of organizational choice frozen time in order to achieve the best production effect.

[Key words] Quick freezing； The best time； Pathological； Gynecological operation

快速冰凍診斷是病理科非常重要的一項(xiàng)工作，病理醫(yī)生需要在手術(shù)進(jìn)行的過程中，用最短的時(shí)間對送檢標(biāo)本進(jìn)行良、惡性的鑒別，為手術(shù)醫(yī)生決定下一步的手術(shù)方案和手術(shù)范圍提供可靠依據(jù)[1]， 上述醫(yī)療環(huán)境，決定了冰凍切片檢查報(bào)告必須準(zhǔn)確、快速。冰凍切片是利用低溫使組織迅速冷凍達(dá)到一定的硬度，利用恒溫切片機(jī)進(jìn)行切片的一種方法[2]，冰凍切片質(zhì)量的優(yōu)劣，制片速度的快慢，無疑會影響病理診斷，增加術(shù)中快速診斷的風(fēng)險(xiǎn)[3]，并與患者的安危息息相關(guān)。我科在制作冰凍切片的過程中，通過不斷的摸索和試驗(yàn)， 對不同的組織標(biāo)本最佳冷凍時(shí)間取得了一些試驗(yàn)成果及經(jīng)驗(yàn)體會，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選取我院病理科2014年1月1日～8月31日婦科快速標(biāo)本350例，其中上皮組織176例（包括乳腺52例、子宮頸32例、子宮內(nèi)膜44例、卵巢囊腫48例），致密結(jié)締組織63例，疏松結(jié)締組織32例，平滑肌組織64例，脂肪組織15例。病種則涵蓋了正常組織、良性腫瘤、交界性腫瘤以及惡性腫瘤。

1.2 液體及儀器設(shè)備

①甲醇固定液、H.E染色液、4%中性緩沖甲醛液；②Leica CM1900冷凍切片機(jī)、Leica2235石蠟切片機(jī)、日本FEATHER一次性刀片、Nikon eclipse 55i顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 冰凍切片的制備及固定 開啟冷凍切片機(jī)，使其環(huán)境溫度固定在-22℃，冷凍頭-22℃，組織托頭表面放少許OCT包埋劑，放于切片機(jī)內(nèi)備用。規(guī)定取材醫(yī)生所取組織塊的大小分別為：乳腺2.0 cm×1.5 cm×0.1 cm，子宮頸2.0 cm×0.5 cm×0.1 cm，子宮內(nèi)膜（含肌壁）2.0 cm×1.5 cm×0.2 cm，卵巢囊壁2.0 cm×0.5 cm，致密結(jié)締組織2.0 cm×1.5 cm×0.1 cm，疏松結(jié)締組織2.0 cm ×1.5 cm×0.2 cm，平滑肌2.0 cm×1.5 cm×0.1 cm，脂肪1.5 cm×1.0 cm×0.1 cm，將取材醫(yī)生切好的組織塊放于冷凍頭上，再用OCT包埋劑裹住組織，放于切片機(jī)內(nèi)讓其自然冷卻。組織冷凍2 min左右時(shí)（冷凍剛完全，此時(shí)組織中心已開始由紅變白）切片一張，立即放于甲醇固定液中固定，加2 min后再切片一張，同上固定，加5 min后再切片一張，同上固定。以上切片均固定30 s，厚度均為4 μm，然后均執(zhí)行常規(guī)H.E染色。剩余組織放于4%中性緩沖甲醛液中固定3 h，再放于70%酒精中保存，待常規(guī)取材時(shí)再統(tǒng)一脫水制作成石蠟切片。

1.3.2 H.E染色 將已固定的切片用水沖洗后，放入預(yù)至50℃左右的蘇木素染色液中染0.5～1.0 min，取出水洗數(shù)秒，用體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇分化，水洗后放入40℃～60℃熱水中藍(lán)化。然后置入（5～10）g/L伊紅液染10 s，水洗。體積分?jǐn)?shù)80%～100%梯度乙醇脫水至二甲苯，封固[4]。以上各道酒精及二甲苯中，玻片均震蕩數(shù)次，顯微鏡下對其觀察。

1.4 質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

質(zhì)量等級分三級：A級：組織結(jié)構(gòu)清晰，染色對比度好，細(xì)胞染色質(zhì)及核膜清楚，細(xì)胞大小一致，染色質(zhì)透明度好，與石蠟切片相差無幾；B級：基本同前，組織結(jié)構(gòu)不夠清晰，但不影響診斷；C級：組織結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞明顯比石蠟切片大，影響診斷[5]。

2 結(jié)果

使用上述方法制得切片，在光鏡下依據(jù)染色對比度、組織切片完整情況及組織形態(tài)結(jié)構(gòu)等質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級，見表1。在本實(shí)驗(yàn)中“冷凍2 min左右”時(shí)各類組織結(jié)構(gòu)都較清晰，染色對比度好，細(xì)胞染色質(zhì)及核膜清楚，染色質(zhì)透明度好，而隨著冷凍時(shí)間加長，細(xì)胞腫脹明顯，細(xì)胞間隙加大，組織形態(tài)變異較大（圖1～4）。表2為切片能作出正確診斷百分率的統(tǒng)計(jì)表，其計(jì)算公式：切片能作出正確診斷百分率=（A級例數(shù)+B級例數(shù)）/（A級例數(shù)+B級例數(shù)+C級例數(shù)）。表1和表2中的石臘切片作為對照列于表格右列。

本試驗(yàn)共有標(biāo)本350例，“冷凍2 min左右”時(shí)的切片，A級+B級切片之和為332例，占總例數(shù)的94.9%，C級為18例，占5.1%；“加2 min后”的切片，A級+B級切片之和為329例，占總例數(shù)的94.0%，C級21例，占6.0%；而“加5 min后”的切片，A級+B級切片之和為236例，占總例數(shù)的百分率則降為67.4%，C級為114例則升至32.6%。從上述三組數(shù)字看，前兩組，總體差異不大，均取得較滿意的效果。而“加5 min后”組與前兩組有比較明顯差距，正確率較差。不過，每一組內(nèi)不同的標(biāo)本組織間正確率也不盡相同。應(yīng)該指出的是，脂肪組織的切片滿意度都不佳，三組正確率均不到50%。

3 討論

3.1關(guān)于表格

日常工作中快速診斷結(jié)果要從收到標(biāo)本開始算起30分鐘內(nèi)完成，為給診斷醫(yī)生留有充足的診斷時(shí)間，故本實(shí)驗(yàn)采用“2 min左右”、“加2 min后”和“加5 min后”這3個(gè)時(shí)間段，而2 min左右時(shí)組織一般都會凍硬95%左右，均能切出片子。A級和B級的切片均能做出正確診斷，故A級和B級的切片作為同一種類型的切片，而C級的切片不能做出診斷，故其單獨(dú)作為一類切片，故能做出正確診斷百分率=（A級例數(shù)+B級例數(shù)）/（A級例數(shù)+B級例數(shù)+C級例數(shù)）。本實(shí)驗(yàn)中“上皮組織”和“疏松結(jié)締組織”在“冷凍2 min左右”、“加2 min后”這兩種情況下，“切片能作出正確診斷的百分率”（以下簡稱百分率）均在92%以上，說明以上皮細(xì)胞為診斷依據(jù)的病例，要想獲得優(yōu)良的冷凍切片，最好在拿到組織后5 min之內(nèi)作出切片，超出這個(gè)時(shí)間段，即使能切出切片也不利于診斷，甚至?xí)斐烧`診。以“致密結(jié)締組織”和“平滑肌組織”為主要診斷依據(jù)的兩類標(biāo)本，在“冷凍2 min左右”、“加2 min后”和“加5 min后”這三種情況下的百分率相差不大，說明這兩類標(biāo)本的冷凍時(shí)間對切片的優(yōu)良率影響不大。脂肪組織在本實(shí)驗(yàn)狀況下，百分率都非常低，說明-22℃不利于脂肪組織的制片。

3.2 最佳冷凍時(shí)間

由于病理科日常工作中每日需要面對大量的快速標(biāo)本，針對不同組織不斷調(diào)節(jié)冰凍切片機(jī)溫度的可操作性不大，一般都是先設(shè)定固定的冷凍環(huán)境和冷凍頭的溫度，再通過縮短或延長冰凍時(shí)間，使組織達(dá)到最佳的冰凍切片效果。試驗(yàn)結(jié)果證明，不同的組織種類需要冷凍的時(shí)間各不相同。從表2可以看出：上皮組織冷凍的時(shí)間越長，正確率就越低。在“冷凍2 min左右時(shí)”狀態(tài)下，宮頸和卵巢能達(dá)100%，而子宮內(nèi)膜也能達(dá)97.7%，而在“加5 min后”均則下降到60%以下。這是因?yàn)殡S著冷凍時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液的失衡就會非常明顯，細(xì)胞核腫脹似假復(fù)層上皮，異型性大，且細(xì)胞器的形態(tài)變化也會非常明顯，不易與不典型增生區(qū)分開，不利于診斷，甚至可能導(dǎo)致誤診。

表2結(jié)果顯示，含纖維成分多的致密結(jié)締組織，冷凍時(shí)間的長短對制片結(jié)果影響不大，試驗(yàn)中三個(gè)時(shí)間段正確率均在93%以上。但應(yīng)該注意的是，纖維成分越多組織的韌性越大，冷凍時(shí)間稍長，組織就會堅(jiān)韌難切，且易出現(xiàn)呈碎屑或條痕狀，這時(shí)可在切出完整平面后用戴手套的拇指按壓或在組織切面上哈氣回溫，或?qū)⒔M織拿出在室溫放置15～20 s，使組織回軟后再切，可以避免切片出現(xiàn)粉末[6]，但是這樣會耽誤手術(shù)時(shí)間，增加患者的痛苦。

此外，富含水分的疏松結(jié)締組織冷凍時(shí)間超過2 min，正確率雖然下降但并不明顯，超過4 min后， 正確率會急速降至62.5%，可能與水分從膠體狀態(tài)的蛋白中分離出來形成冰晶[7]有關(guān)。冰晶能引起細(xì)胞腫脹，細(xì)胞之間相互擠壓出現(xiàn)縫隙，從而使組織失去原有結(jié)構(gòu)，因而導(dǎo)致切片正確率下降，誤診幾率增加。

致于平滑肌組織，表2數(shù)據(jù)顯示，冷凍時(shí)間的長短對正確率沒有太大影響。應(yīng)該注意的是，冷凍時(shí)間稍長，組織就會堅(jiān)韌很難切，這時(shí)只有把該組織放于外環(huán)境一段時(shí)間或用手撫摸讓其回溫才能好切片，但同樣也會耽誤手術(shù)時(shí)間。

富含脂肪的組織在-22℃環(huán)境下，本試驗(yàn)未能取得好的結(jié)果，正確率均低于50%，表明-22℃狀況下，對于脂肪組織，冷凍時(shí)間應(yīng)大大延長。或者可以將溫度降低到更低溫度，同時(shí)增加切片的厚度。亦有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用速凍的制片方法制出較好的組織冷凍切片，但和本文的探討目的不同，故未加實(shí)驗(yàn)。

3.3 因材施技

術(shù)中快速冰凍切片操作時(shí)間比常規(guī)切片要短，細(xì)胞的形態(tài)與常規(guī)石臘片相比有較大差異，因此制作一張好的冰凍切片比石臘切片要難。優(yōu)質(zhì)冰凍切片應(yīng)厚薄均勻，完整無皺褶、無裂紋，鏡下組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞染色上乘，色澤鮮艷[8]。為保證切片有較好的質(zhì)量，在日常工作中，我們有以下幾點(diǎn)體會：一是標(biāo)本要新鮮，忌浸入乙醇、甲醛，避免過多的水分，防止組織脫水、冰晶形成和組織變形[9]；二是取材要平整規(guī)則，避開壞死出血區(qū)，盡量剔除脂肪、毛發(fā)、硬骨等[10]；三是要控制組織塊的厚度，不宜太厚，組織越厚，冷凍需要的時(shí)間就越長，組織中的水分則會越容易被冰凍形成冰晶， 因此必須保證組織厚度不能超過0.3 cm，并促其速凍避免冰晶的形成。四是要保持刀片的鋒利，防止切片皺縮或卷縮，切片時(shí)進(jìn)刀要緩慢勻速用力均勻，注意修切時(shí)暴露出組織的最大切面，并使帶有包膜的組織包膜出現(xiàn)，同時(shí)注意清潔，防止切片被污染；五是對于一些小的、零碎的標(biāo)本，如宮內(nèi)膜等，應(yīng)該用較多量的包埋劑包埋；第六要注意的是，切片染色質(zhì)量的好壞在很大程度上直接影響快速冰凍切片診斷的準(zhǔn)確性，因此，染色時(shí)盡量振動(dòng)切片，使組織與固定液、染色液、脫水液盡快融合、分離，加快染色速度，提高快速冰凍切片的成片質(zhì)量和速度[11]。

冰凍切片的主要技術(shù)特點(diǎn)是利用低溫使待檢組織變硬然后制成切片，因其具有方便快速之優(yōu)勢， 越來越被廣泛使用。然而在冰凍切片過程中有許多制約因素，如操作不當(dāng)也可引起細(xì)胞腫脹、收縮、組織間裂隙，結(jié)構(gòu)不清等人為假象，給診斷帶來風(fēng)險(xiǎn)[12]?？梢娮龊靡粡埍鶅銮衅恢皇菚衅敲春唵蔚膯栴}，還需要病理技術(shù)人員具有嚴(yán)格的責(zé)任心、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度、豐富的工作實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)[13]，在日常工作中只有不斷摸索、積累經(jīng)驗(yàn)，才能更好地為臨床服務(wù)。

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（收稿日期：2014-09-04）