[摘要] 目的 探討六味地黃湯抗腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。 方法 5/6腎切除法制備慢性腎衰模型，分假手術(shù)組、模型組、六味地黃湯組和依那普利組。六味地黃湯組予以6.25 g/（kg·d）六味地黃湯灌胃，依那普利組予以10 mg/（kg·d）依那普利灌胃，假手術(shù)組和模型組予以10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃12周。造模12周后，應(yīng)用免疫組化法和RT-PCR法分別檢測HIF-1α、PAI-1在腎組織中蛋白水平和基因表達(dá)。 結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織中HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表達(dá)均明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，六味地黃湯組和依那普利組大鼠腎組織中HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表達(dá)均明顯降低（P<0.05），且六味地黃湯組低于依那普利組（P<0.05）。 結(jié)論 六味地黃湯可能通過降低HIF-1α，進(jìn)而下調(diào)PAI-1的表達(dá)抑制腎間質(zhì)纖維化，且治療效果優(yōu)于依那普利。

[關(guān)鍵詞] 腎纖維化；缺氧誘導(dǎo)因子1α；纖溶酶原激活物抑制劑-1；六味地黃湯

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）36-0009-04

Effects of six ingredient rehmannia decoction on expression of HIF-1α and PAI-1 in chronic renal failure rats

TANG Qun1 ZHANG Xi1 WU Hua2 CHEN Li1 LIU Chunyan1

1.Department of Pathology， Hu’nan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2.Furong Judicial Identification Center， the Second people's Hospital of Hu’nan Province， Changsha 410007， China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of six ingredient rehmannia decoction against renal interstitial fibrosis. Methods The rat model of renal interstitial fibrosis were induced by 5/6 nephrectomy， rats were divided into sham operation group， model group， six ingredient rehmannia decoction group and enalapril group. Six ingredient rehmannia decoction group was given 6.25 g/（kg·d） of six ingredient rehmannia decoction gavage， enalapril group was given 10 mg/（kg·d） enalapril lavage， sham operation group and model group were given 10 mL/（kg·d） of distilled water， 1 times a day， continuous intragastric administration for 12 weeks. 12 weeks after modeling， immunohistochemical method and RT-PCR method were used to detect protein levels and gene expression of HIF-1α and PAI-1 in renal tissue respectively. Results Compared with the sham operation group， the renal tissue of HIF-1 α， PAI-1 protein level and gene expression were increased significantly in model group（P<0.05）； Compared with the model group， the renal tissue of HIF-1 α， PAI-1 protein levels and gene expression were decreased significantly in six ingredient rehmannia decoction group and enalapril group（P<0.05）， and the six ingredient rehmannia decoction group was better than that of enalapril group（P<0.05）. Conclusion Six ingredient rehmannia decoction can decrease the HIF-1 α， and down regulate the expression of PAI-1 inhibits renal interstitial fibrosis， and the treatment effect is better than that of enalapril.

[Key words] Renal fibrosis； Hypoxia-inducible factor 1α； Plaminogen activator inhibitor-1； Six ingredient rehmannia decoction

慢性腎臟病早期腎內(nèi)普遍存在缺氧，且缺氧是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因素[1]。慢性腎臟病時，腎內(nèi)缺氧可誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）表達(dá)增加，后者可上調(diào)一系列致纖維化靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)腎纖維化進(jìn)展[2]。纖溶酶原激活物抑制劑-1（plaminogen activator inhibitor-1，PAI-1）是重要的促纖維化因子，且缺氧誘導(dǎo)的PAI-1基因表達(dá)受HIF-1α調(diào)控[3]。因此，本研究旨在通過對HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表達(dá)的檢測，觀察六味地黃湯是否能下調(diào)HIF-1α、PAI-1的表達(dá)，從而抑制5/6腎切除模型中大鼠腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，為慢性腎臟疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康雄性SD 大鼠70只，鼠齡4～5周，體質(zhì)量（180±20）g，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房，動物合格證號：SCXK（湘）2009-0001。

1.1.2 藥物制備 六味地黃湯（配方：熟地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g），由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。每劑藥材75 g，每天煎一劑。藥材先用相當(dāng)于藥材5倍量的自來水浸泡20 min，煮沸后再微火煮20 min，過濾得一煎液，剩余藥渣再加少量蒸餾水，煎煮得二煎液，兩煎液混合，3層紗布過濾后置水浴恒溫器，濃縮至含生藥1 g/mL。依那普利（湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司，10 mg×16 s，國藥準(zhǔn)字H20066383），每片10 mg溶解于10 mL生理鹽水，藥液濃度為1 mg/mL。

1.1.3 主要試劑 一抗兔抗大鼠HIF-1α、PAI-1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，二抗山羊抗兔IgG 抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；免疫組化檢測試劑盒、DAB 顯色試劑盒購自武漢博士德公司，Trizol購自美國MRC公司，Taq DNA 聚合酶、dNTPs和RT 試劑盒均購自美國Fermentas公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 造模 SD 雄性大鼠70只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（10只）、模型組（20只）、六味地黃湯組（20只）和依那普利組（20只）。模型組、六味地黃湯組和依那普利組均在無菌條件下進(jìn)行5/6腎切除術(shù)，0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射 10%水合氯醛麻醉大鼠，常規(guī)消毒、鋪巾、剖腹、迅速切除左腎上、下極，明膠海綿壓迫止血，復(fù)位腎臟，縫合腎臟各層組織。一周后切除對側(cè)腎臟。假手術(shù)組僅打開腹腔暴露腎臟，但不切除。

1.2.2 給藥 造模后第2天，六味地黃湯組予以六味地黃湯6.25 g/（kg·d）灌胃，依那普利組予以10 mg/（kg·d）依那普利灌胃，假手術(shù)組和模型組以10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃，1次/d，連續(xù)12周。大鼠在給藥過程中途死亡者直接予以剔除。

1.2.3 標(biāo)本收集 灌胃12周后，麻醉大鼠，剖腹，腹主動脈取血，代謝籠收集死前24 h尿量，腎組織一部分用10%甲醛固定，用于HE染色和免疫組化檢測。另一部分保存于-80℃超低溫冰箱，用于RT-PCR檢測。

1.2.4 腎功能檢測 Elisa法檢測24 h尿白蛋白（24 h UAlb），酶法測定血肌酐（SCr）濃度，尿素酶-GLDH法測定尿素氮（BUN）濃度。

1.2.5 腎臟組織形態(tài)學(xué)檢查 10%甲醛固定腎組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，做4 μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色，顯微鏡觀察各組大鼠腎組織病理變化。

1.2.6 免疫組織化學(xué)法檢測 一抗分別用兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體（工作濃度為1：50）和PAI-1多克隆抗體（工作濃度為1：100），二抗用相應(yīng)山羊抗兔抗體（工作濃度按產(chǎn)品說明書配制為1：100），光學(xué)顯微鏡下觀察每張切片，陽性呈黃色、棕黃色或棕褐色。高倍鏡下（×400）隨機(jī)選取5 個互不重疊的視野，計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測定每個視野陽性染色的平均灰度值，半定量法評估，測得平均灰度值越小，表示免疫陽性程度越強(qiáng)。

1.2.7 RT-PCR檢測 用Trizol法提取總RNA，首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中合成cDNA，然后PCR擴(kuò)增目的基因HIF-1α、PAI-1以及內(nèi)參基因β-actin片段。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，循環(huán)采用94℃變性0.5 min，退火時間1 min，退火溫度（HIF-1α：57.5℃，PAI-1：59℃），72℃延伸1 min，30個循環(huán)后，72℃延伸10 min，4℃存放。引物序列：HIF-1α 上游5’-GTTTA CTAAAGGACAAGTCACC-3’，下游5’-TTCTGTTTGTTGAAG-GGAG-3’；PAI-1上游5’-GGCTTCATGCCCCACTTCTTC-3’，下游5’-ATTCACCAGCACCAGGCGTGT-3’；β-actin上游5’-ACCCACACTGTGCCCATCTATGA-3’，下游5’-CATCGGAACCGCTCATTGCCGATAG-3’。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，Tanon GIS 2020凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，圖像分析獲得條帶累積光密度數(shù)值，以β-actin為內(nèi)參對照，計(jì)算HIF-1α/β-actin、PAI-1/β-actin比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LDS法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠24 h尿蛋白、血清尿素氮和血肌酐比較

模型組大鼠24 h尿蛋白、血清尿素氮和血肌酐較假手術(shù)組均明顯升高（P<0.05）；而六味地黃湯組和依那普利組較模型組均明顯降低（P<0.05），且六味地黃湯組降低更明顯（P<0.05）。見表1。

表1 四組大鼠24 h尿蛋白、血清尿素氮和血肌酐比較（x±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與六味地黃湯組比較，cP<0.05

2.2 四組大鼠腎組織HE染色結(jié)果比較

假手術(shù)組腎小球結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊；模型組大部分腎小球硬化，腎小管萎縮、消失，部分管腔內(nèi)可見蛋白管型，腎間質(zhì)纖維化明顯；六味地黃湯組和依那普利組腎小球硬化、腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化程度均有不同程度減輕，見圖1。

圖1 造模12周后四組大鼠腎組織HE染色結(jié)果比較（×400）

A假手術(shù)組；B模型組；C六味地黃湯組；D依那普利組

2.3 免疫組化結(jié)果比較

2.3.1 HIF-1α的表達(dá) 假手術(shù)組HIF-1α在大鼠腎組織內(nèi)微量表達(dá)，模型組在大鼠腎小管上皮細(xì)胞胞漿、核內(nèi)表達(dá)呈棕褐色；六味地黃湯組和依那普利組在大鼠腎小管上皮細(xì)胞胞漿、核內(nèi)表達(dá)呈棕黃色或黃色，見圖2。

2.3.2 PAI-1的表達(dá) 假手術(shù)組PAI-1在大鼠腎組織內(nèi)微量表達(dá)；模型組表達(dá)量明顯增加，腎小管上皮細(xì)胞胞核、刷狀緣有棕褐色陽性顆粒；六味地黃湯組和依那普利組表達(dá)減弱，陽性顆粒呈棕黃色，見圖3。

2.3.3 四組腎組織HIF-1α、PAI-1免疫陽性細(xì)胞半定量比較 見表2。模型組HIF-1α、PAI-1免疫陽性細(xì)胞半定量較假手術(shù)組明顯降低（P<0.05）；六味地黃湯組和依那普利組HIF-1α、PAI-1免疫陽性細(xì)胞半定量較模型組升高（P<0.05），且六味地黃湯組升高更明顯。免疫陽性細(xì)胞半定量越低，其蛋白表達(dá)越高，所以與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織中HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表達(dá)均明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，而六味地黃湯組和依那普利組大鼠腎組織中HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表達(dá)均明顯降低（P<0.05），且六味地黃湯組低于依那普利組（P<0.05）。

表2 四組大鼠腎組織HIF-1α、PAI-1免疫陽性細(xì)胞半定量比較（x±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與六味地黃湯組比較，cP<0.05

2.4四組腎組織HIF-1α、PAI-1 mRNA相對表達(dá)量比較

模型組HIF-1α、PAI-1 mRNA的表達(dá)較假手術(shù)組明顯增加（P<0.05），而六味地黃湯組和依那普利組HIF-1α、PAI-1 mRNA的表達(dá)較模型組明顯降低（P<0. 05），且六味地黃湯組降低更明顯，見表3。

3 討論

慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）主要病理學(xué)特征為腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。慢性缺氧可導(dǎo)致腎小管間質(zhì)損傷，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化[4]。缺氧主要通過HIF-1 及其氧敏感元件HIF-1α發(fā)揮作用[5]。因此，HIF-1α被認(rèn)為是導(dǎo)致纖維化的關(guān)鍵因子[6]。已有研究表明，HIF-1α可調(diào)控促纖維化因子PAI-1的表達(dá)[7]， PAI-1是纖溶酶原激活物抑制劑（PAIs）的主要形式，PAIs是PAs的生理性特異抑制物。PA與PAI-1是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）降解過程中保持蛋白質(zhì)溶解與抗蛋白溶解間平衡的主要參與者。在組織內(nèi)PAI-1水平升高和（或）活性增強(qiáng)，可抑制纖溶酶原激活物對ECM降解，引起ECM聚集，導(dǎo)致組織纖維化。

六味地黃湯出自北宋錢乙《小兒藥證直訣》，為六味地黃丸改為湯劑，其由熟地黃、山萸肉、懷山藥、牡丹皮、澤瀉、茯苓六味藥組成，主治腎陰虛證。六味地黃丸（湯）是臨床上治療腎陰虛證型慢性腎小球腎炎的有效方劑[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯可明顯改善5/6腎切除大鼠早期（造模后8周）腎功能和腎臟病理改變，減少腎組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白的積聚，從而延緩腎間質(zhì)纖維化[9]。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯對5/6腎切除大鼠晚期（造模后12周）亦有很好的治療效果。六味地黃湯可下調(diào)5/6腎切除大鼠腎組織中CTGF、PDGF-A、PDGF-B的表達(dá)，從而抑制腎間質(zhì)纖維化[10，11]。但其對HIF-1α、PAI-1蛋白和基因表達(dá)的影響尚未闡明。

依那普利是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑類藥物，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑不僅可通過降壓、減少尿蛋白保護(hù)腎臟，還能通過減少腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的蓄積，減少腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化，延緩腎損害進(jìn)展。因此，本研究選用依那普利作為陽性對照藥物。結(jié)果顯示與模型組相比較，六味地黃湯組BUN、SCr及24 h尿蛋白均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且腎臟病理學(xué)改變較模型組明顯減輕，說明六味地黃湯可改善晚期慢性腎衰大鼠腎功能，減輕腎間質(zhì)纖維化程度。與模型組相比較，六味地黃湯組和依那普利組大鼠腎組織內(nèi)HIF-1α、PAI-1的蛋白水平和mRNA表達(dá)明顯升高和降低，且六味地黃湯組升高和降低更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明兩種藥物均能抑制晚期慢性腎衰大鼠腎間質(zhì)纖維化，且六味地黃湯的治療效果優(yōu)于依那普利。同時，提示六味地黃湯抗腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制可能與其下調(diào)腎組織內(nèi)HIF-1α、PAI-1的表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2014-11-03）