[摘要] 真菌已成為醫(yī)院獲得性感染的重要病原體，在抗真菌治療過(guò)程中耐藥性真菌的增加引起醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注，真菌生物膜的發(fā)現(xiàn)和其在真菌耐藥性中發(fā)揮的作用引起學(xué)者廣泛的重視，真菌生物膜耐藥與防治研究不斷進(jìn)入新領(lǐng)域。該文旨在闡明真菌生物膜的重要性，從生物膜的胞外機(jī)制、外排泵基因表達(dá)以及藥物靶點(diǎn)的基因變異幾個(gè)方面來(lái)闡述真菌生物膜的耐藥機(jī)制，總結(jié)真菌生物膜病防治的最新研究進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞] 真菌；生物膜；耐藥機(jī)制

[中圖分類(lèi)號(hào)] R379 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2014）09（c）-0197-02

由于臨床廣譜抗菌藥物治療、器官移植、免疫抑制劑治療、內(nèi)置醫(yī)療器材治療、放化療以及艾滋病等免疫缺陷性疾病流行使得真菌感染的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，由于效率低下的診斷方法和不恰當(dāng)?shù)某跏伎拐婢委熓拐婢腥舅劳雎矢哌_(dá)45%[1]。真菌感染分離的真菌性病原微中白假絲酵母菌感染所占比例55%以上，甚至有報(bào)道高達(dá)66.7%[2-3]，真菌耐藥性發(fā)生是臨床抗真菌治療效果不佳的重要原因，已證實(shí)病原真菌生物膜的形成是真菌產(chǎn)生耐藥性重要因素之一[4]，臨床上大約有65%的感染與微生物在組織、器官或醫(yī)療設(shè)備表面形成生物膜有關(guān)。該文從常見(jiàn)致病菌生物膜的形成的結(jié)構(gòu)及影響因素、生物膜可能的耐藥機(jī)制以及真菌生物膜病的防治方法等幾個(gè)方面進(jìn)行綜述，闡明當(dāng)前臨床對(duì)真菌生物膜耐藥機(jī)制與防治研究進(jìn)展。

1 生物膜的結(jié)構(gòu)及影響因素

1.1 生物膜的結(jié)構(gòu)

生物膜是真菌形成菌落的生存方式，Chandra等通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)白色念珠菌生物膜超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)生物膜（biofilm）是微生物群落為了自我保護(hù)而產(chǎn)生的一種可黏附組織表面由其自身產(chǎn)生的細(xì)胞外聚合物基質(zhì)（ECM）包裹的三維結(jié)構(gòu)菌細(xì)胞群體，對(duì)生物膜形成過(guò)程分進(jìn)行詳細(xì)觀察后將其形成過(guò)程分為早、中、晚3 個(gè)階段[5-6]。

1.2 生物膜形成的影響因素

生物膜的形成受包括宿主的免疫狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)成分、藥物以及生長(zhǎng)環(huán)境的物理、化學(xué)因素等多種因素影響。孫秋寧等研究發(fā)現(xiàn)血清及組織液有增加念珠菌粘附于生物材料表面的作用，能夠明顯增加生物膜念珠菌活性，可以促進(jìn)生物膜形成[7]。

早在2002年就有研究報(bào)道白色念珠菌可以分泌一種容量感應(yīng)分子法尼醇可以抑制白色念珠菌生成菌絲從而控制細(xì)胞增殖避免過(guò)量細(xì)胞造成的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)， 同時(shí)促使菌體游離形成新生物膜，在生物膜形成中起重要作用[8]。

2 生物膜的耐藥機(jī)制

2.1 生物膜的屏障作用

細(xì)胞外聚合物基質(zhì)（ECM）是組成生物被膜結(jié)構(gòu)的基質(zhì)物主要由碳水化合物、蛋白質(zhì)等成分組成。 碳水化合物中的主要組成部分β-1，3葡聚糖由位于細(xì)胞膜中β-1，3葡聚糖合成酶催化合成，β-1，3葡聚糖能螯合唑類(lèi)抗真菌藥物的被稱(chēng)為“藥物海綿”，能夠吸附大量抗真菌藥物從而延遲藥物滲入起到物理屏障作用，是白念珠菌生物膜耐藥的重要原因[9]。

2.2 生物膜外排泵基因及相關(guān)表達(dá)

真菌基因組研究證實(shí)真菌基因組中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因所表達(dá)的蛋白產(chǎn)物中ATP 結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族和主要易化子超家族（MFS）是真菌主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族是一種ATP 結(jié)合型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括五個(gè)蛋白家族，是主要外排蛋白，被命名為多藥耐藥家族（MDR）、多藥耐藥相關(guān)蛋白家族（MRP）和多效性耐藥家族（PDRI）的3個(gè)蛋白家族與胞內(nèi)毒性物質(zhì)的外排密切相關(guān)[10]。MFS 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白其中兩個(gè)家族，與外排毒性物質(zhì)功能相關(guān)。ABC和MFS的高表達(dá)可引起多種抗真菌藥特別是三唑類(lèi)抗真菌藥物交叉耐藥[11]。Mukherjee 等通過(guò)建立基因缺失的菌株模型和檢測(cè)藥物外排泵的功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)外排泵僅在生物膜形成早期在相關(guān)耐藥性中起著重要作用[12]。

2.3 藥物靶點(diǎn)基因變異

抗真菌藥物作用機(jī)理大致可分為3種：①與真菌細(xì)胞膜成分結(jié)合破壞細(xì)胞膜完整性，如多烯類(lèi)；②抑制關(guān)鍵酶活性，阻止細(xì)胞壁或細(xì)胞膜成分合成，如烯丙胺類(lèi)、氮唑類(lèi)和棘白菌素類(lèi)；③干擾有絲分裂和DNA合成，如嘧啶類(lèi)、抗生素類(lèi)。臨床常見(jiàn)感染性真菌對(duì)多烯類(lèi)藥物如兩性霉素B耐藥非常罕見(jiàn)，耐藥性研究較少，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為真菌對(duì)多烯類(lèi)藥物內(nèi)要可能存在3種假說(shuō)[13-14]：①兩性霉素B穿過(guò)真菌細(xì)胞壁通路發(fā)生改變；②細(xì)胞膜中脂類(lèi)發(fā)生改變，兩性霉素B與細(xì)胞膜結(jié)合機(jī)率降低了；③真菌細(xì)胞對(duì)兩性霉素B藥物作用敏感性降低。有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)體外誘導(dǎo)使ERG3基因突變使細(xì)胞膜中麥角固醇合成障礙導(dǎo)致兩性霉素B耐藥[15]。平滑假絲酵母CgERG6基因的突變促進(jìn)假菌絲的生長(zhǎng)是平滑假絲酵母耐藥株對(duì)多烯類(lèi)藥物敏感性降低的原因。臨床分離的烯丙胺類(lèi)耐藥菌株較少，對(duì)耐藥株的角鯊烯環(huán)氧化酶編碼基因（SE）進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)1個(gè)氨基酸L393F突變，可能是其產(chǎn)生耐藥性的原因。氮唑類(lèi)抗真菌藥物耐藥的原因是編碼其作用靶酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶的ERG11基因變異或過(guò)度表達(dá)。棘白菌素類(lèi)是由于編碼β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶的FKS1和/或FKS2基因點(diǎn)突變，導(dǎo)致真菌對(duì)脂肽類(lèi)抗菌藥物的敏感性明顯降低。

真菌對(duì)氟胞嘧啶原發(fā)性耐藥很低（<2%），繼發(fā)性耐藥依賴(lài)與嘧啶藥物作用不同靶酶的失活：①真菌通過(guò)編碼胞嘧啶通透酶的基因fcy2點(diǎn)突變，影響藥物的吸收降低細(xì)胞內(nèi)藥物積累。②編碼胞嘧啶脫氨酶基因fcy1或編碼尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因fur1的點(diǎn)突變也可以導(dǎo)致獲得性氟胞嘧啶耐藥。這些酶催化5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-氟尿苷一磷酸，使藥物反起作用。最常見(jiàn)的獲得性耐藥氟胞嘧啶是基于fur1基因點(diǎn)突變。

3 真菌生物膜病的防治

3.1 傳統(tǒng)藥物防治

采取聯(lián)合使用藥物的治療策略，例如兩性霉素B與氟胞嘧啶，氟胞嘧啶與氟康唑，兩性霉素B與氟胞嘧啶，卡泊芬凈與脂質(zhì)體兩性霉素B，卡泊芬凈與氟康唑等的聯(lián)合用藥，使藥物協(xié)同抗菌作用發(fā)揮療效。

開(kāi)發(fā)抗真菌藥物的新劑型，如兩性霉素B脂質(zhì)體，兩性霉素B脂質(zhì)復(fù)合物，兩性霉素B膠體分散體，伊曲康唑，和β-環(huán)糊精伊曲康唑等新劑型，藥物新機(jī)型對(duì)真菌生物膜作用明顯但作用機(jī)理尚不清楚。

3.2 新藥物開(kāi)發(fā)

3.2.1 天然植物提取 植物中含有大量的生物活性分子，精油的主要成分是植物提取物，其對(duì)不同微生物的具有較強(qiáng)的抗菌活性，在這方面萜烯、香芹酚、香葉醇、和麝香草酚在白色念珠菌感染醫(yī)療設(shè)備的防治中的作用已被證實(shí)。另外，萜類(lèi)化合物具有優(yōu)良的抗白念珠菌酵母和菌絲形式生長(zhǎng)活性且對(duì)HeLa細(xì)胞無(wú)毒。因此，在不久的將來(lái)萜類(lèi)化合物可能不僅作為一種抗真菌藥物單獨(dú)使用還可以協(xié)同常規(guī)藥物如氟康唑用于抗真菌治療。鐘羅楓等人通過(guò)體外培養(yǎng)白色念珠菌生物膜，在生物膜生成不同階段給予紫檀芪證實(shí)其對(duì)白色念珠菌生物膜具有顯著抑制作用。

3.2.2 人工合成 菌藥物的第2個(gè)來(lái)源包括非聚合合成劑，可分為四組。第1組是一類(lèi)以N，N-二甲雙胍復(fù)合物為基礎(chǔ)的化學(xué)制品，由于這些化合物顯示出較低的細(xì)胞毒性，因此可作為潛在的廣譜抗生素。第2組是一類(lèi)傳統(tǒng)抗真菌藥物結(jié)構(gòu)的衍生化合物，其中一些比原來(lái)的結(jié)構(gòu)有著更好的抗菌作用。第3組是由合成的肽類(lèi)物質(zhì)組成的，即“人乳鐵蛋白衍生肽”，其在臨床前期試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)有著很好的耐受性。最后一組是半合成天然產(chǎn)物的衍生物，如棘白菌素衍生物，米卡芬凈鈉，阿尼芬凈，乙酸卡泊芬凈和紐莫康定。這些改進(jìn)的藥物在某些性能上優(yōu)于初始的天然產(chǎn)物?？上У氖?，棘白菌素衍生物的口服給藥時(shí)吸收差，因此僅用于靜脈注射。在白色念珠菌的治療上，一種可以與醋酸卡泊芬凈媲美的天然的抗真菌成分已經(jīng)分離出來(lái)。這種成分被命名為綠原酸擬肽，是一種新的抑制（1，3）-β-D-葡聚糖合成酶的三萜糖苷。從綠原酸擬肽衍生的幾種合成產(chǎn)品，目前正在開(kāi)發(fā)中，以?xún)?yōu)化在體內(nèi)的抗真菌活性和口服療效。

3.3 中草藥應(yīng)用

在抗真菌治療中傳統(tǒng)中藥不良反應(yīng)小、標(biāo)本兼治的優(yōu)勢(shì)逐步顯現(xiàn)出來(lái)，具有獨(dú)特的抗菌機(jī)制和提高機(jī)體免疫力的作用。汪長(zhǎng)中等人通過(guò)制作念珠菌的生物膜， 不同生長(zhǎng)時(shí)期給予中藥，發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)醋、黃芩苷對(duì)的生物膜具有較強(qiáng)的抑制作用。 許穎等人研究發(fā)現(xiàn)五倍子煎液對(duì)初期階段的白念珠菌生物膜具有抑制作用。目前已發(fā)現(xiàn)近300種中草藥如姜黃油、山蒼子油、大蒜、太子參、白術(shù)、黃茂、土模皮、大黃等具有較強(qiáng)的抗真菌的作用，并能有效抑制菌的生物膜形成。

4 結(jié)語(yǔ)

雖然隨著真菌生物膜形成機(jī)理和耐藥機(jī)制的研究不斷深入，研究學(xué)者不斷發(fā)現(xiàn)新的抗真菌藥物和治療方法，但是由于體內(nèi)外的差異性和耐藥性菌株的不斷出現(xiàn)，臨床在真菌感染的防治任然面臨巨大的挑戰(zhàn)，需要不斷的研究和探討。

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（收稿日期：2014-06-22）