[摘要] 目的 探討反式白藜蘆醇（TR，Trans-Resveratrol）對(duì)Aβ25-35損傷大鼠海馬NMDA受體NR1、NR2A亞基表達(dá)的影響。方法 選擇經(jīng)莫式水迷宮（MWM）訓(xùn)練合格的大鼠，隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組；模型組；TR高劑量組、TR中劑量組、TR低劑量組、安理申對(duì)照組。模型組通過在大鼠海馬內(nèi)注射Aβ25-35制模獲得，在模型組基礎(chǔ)上分別用TR高、中、低劑量TR干預(yù)獲得TR高劑量組、TR中劑量組、TR低劑量組，同時(shí)用安理申干預(yù)獲得安理申對(duì)照組，每組6只，采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)法（real time PCR）檢測(cè)6組大鼠海馬NMDA受體NR1、NR2A表達(dá)。 結(jié)果 在MWM中模型組逃避潛伏期比TR高、中、低劑量組、安理申組和假手術(shù)組明顯延長，各組NMDA受體NR1表達(dá)分別為（0.14±0.04）， （1.51±0.54）， （0.22±0.06）， （0.37±0.08，0.61） ± 0.15）（LOW），（0.97±0.16）（安理申）。各組NMDA受體NR2A表達(dá)分別為（0.12±0.07）、（1.72±0.34）、（0.16±0.06）、（0.21±0.08）、（0.52±0.15）、（0.67±0.16）。結(jié)論 TR可能有下調(diào)海馬NMDAR1 、NMDAR2A受體表達(dá)，從而減少海馬細(xì)胞凋亡的作用。

[關(guān)鍵詞] 反式白藜蘆醇；癡呆；大鼠；NMDA受體

[中圖分類號(hào)] R725 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2014）09（c）-0011-03

海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)，是邊緣系統(tǒng)的一個(gè)部分[1]。NMDA受體是谷氨酸受體的一種亞型，參與形成突觸傳遞的長時(shí)增強(qiáng)過程，參與調(diào)解神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，同時(shí)在癲癇、腫瘤等多種重要過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的NMDA受體多達(dá)7種，包括NR1、NR2（A、B、C和D4種）、NR3（A、B2種），NR2各亞單位之間具有很好的相似性，一般將其分為2種亞群[4]。研究表明，反式白藜蘆醇（Trans-Resveratrol， TR）具有一定的抗氧化作用，在防止高血壓、動(dòng)脈硬化及提高機(jī)體免疫力方面有較好的效果[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，利用基因敲除技術(shù)敲除NR1基因后，小鼠CA1區(qū)NMDA受體興奮性突觸后電位消失，癡呆大鼠的海馬突觸傳遞發(fā)生改變，其海馬的NR2A表達(dá)輕度上調(diào)，NR1表達(dá)明顯上調(diào)。經(jīng)TR干預(yù)后海馬及附近腦組織NR1、NR2A表達(dá)均下調(diào)[9]。因此，我們使用顱鉆鉆孔微注棒Aβ25-35注射損傷雙側(cè)大鼠海馬[7-8] ，注射TR后，觀察其對(duì)癡呆大鼠保護(hù)的效果，并檢測(cè)NMDA受體NR1、NR2A的表達(dá)情況，以探求臨床上癡呆病人理想藥物治療的實(shí)驗(yàn)研究方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)用36只雄性大鼠為本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，體重208～225 g，平均體重215 g。反式白藜蘆醇（TR）粉劑購自西安林禾生物技術(shù)有限公司?？辔端豳徸陨ど锕こ蹋ㄉ虾＃┯邢薰?，鹽酸多奈哌齊（安理申）購自衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，Aβ25-35購自SIGMA公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑、熒光液Green Supermix等PCR試劑購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 儀器

冷凍離心機(jī)（德國5417R）、紫外可見分光光度計(jì)（TU-1810）、湘儀 H1650-W離心機(jī)，Thermo Piko Real 96 Real-time system實(shí)時(shí)PCR儀，Bioer XP Cycler普通PCR儀、雙臂腦立體定位儀（68002型RWD life science co）、顱鉆（78001型）、超微量注射棒、Morris水迷宮等。

1.3 動(dòng)物模型制備

選擇經(jīng)莫式水迷宮（MWM）訓(xùn)練合格的大鼠，隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組；模型組；TR高劑量組、TR中劑量組、TR低劑量組、安理申對(duì)照組。模型組通過在大鼠海馬內(nèi)注射Aβ25-35制模獲得，在模型組基礎(chǔ)上分別用TR高、中、低劑量TR干預(yù)獲得TR高劑量組、TR中劑量組、TR低劑量組，同時(shí)用安理申干預(yù)獲得安理申對(duì)照組。

1.4 NMDA受體NR1、NR2A表達(dá)檢測(cè)

利用RT-PCR檢測(cè)NMDA受體NR1、NR2A的表達(dá)，方法參照檢測(cè)試劑盒進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件采用兩步法進(jìn)行，具體步驟為：95 ℃，3 min； 65 ℃，3 min。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較用Levene 檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組NMDA受體NR1、NR2A表達(dá)

各組NRI及NR2A的表達(dá)結(jié)果見表1，與模型組相比，各組NR1及NR2A的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且高劑量組反式白藜蘆醇干預(yù)組的NR1的表達(dá)明顯減少，與中、低劑量反式白藜蘆醇干預(yù)組相比效果好。

表1 NMDAR1在各組的表達(dá)（x±s）

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注：*與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

2.2 TR各劑量組海馬凋亡細(xì)胞病理觀察

TR各劑量組海馬凋亡細(xì)胞病理切片結(jié)果如圖1所示，TR高劑量組海馬的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯低于TR低劑量組、對(duì)照組及模型組，TR低劑量組海馬凋亡細(xì)胞數(shù)相對(duì)對(duì)照組及模型組較少。

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圖1 各組海馬的凋亡細(xì)胞觀察

A：TR高劑量組海馬的凋亡細(xì)胞

B：TR低劑量組海馬的凋亡細(xì)胞

C：正常對(duì)照組海馬的凋亡細(xì)胞

D：模型組海馬的凋亡細(xì)胞

3 討論

海馬是人類腦部的重要區(qū)域，具有調(diào)解神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育的重要作用，是邊緣系統(tǒng)的一個(gè)部分，海馬受損是引起阿爾茨海默病的主要病因[6-7]。

NMDA受體是谷氨酸受體的一種亞型，參與形成突觸傳遞的長時(shí)增強(qiáng)過程，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)海馬神經(jīng)元突觸內(nèi)NMDA受體被阻斷時(shí)，細(xì)胞變性死亡將會(huì)增加[8-10]。海馬中主要表達(dá)的NMDA受體有NR1和NR2A，NR1可以在細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)有功能的同聚受體，但對(duì)激動(dòng)反應(yīng)很小，NR2A不能單獨(dú)形成有功能的通道，只有和NR1組合才能表現(xiàn)活性，并使后者反應(yīng)明顯加強(qiáng)，所以把NR1、NR2A放一起研究并起互相印證的作用[11-13]，研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸可能在神經(jīng)病理變化及癡呆癥狀中起重要作用，在有癡呆的大鼠甘氨酸結(jié)合能力降低，提示NMDA受體的功能缺損，Lu等[15]采用免疫印跡法分析AD 患者死后腦NR1下降39% ，NR2B下降40%，提示NMDA受體的功能缺失后， AD患者嗅內(nèi)皮質(zhì)中NR1mRNA含量較正常人下降34%，而用用高壓液相色譜分析腦組織標(biāo)本中的右旋- 天冬氨酸含量發(fā)現(xiàn)[16] AD患者的天冬氨酸較相同年齡正常對(duì)照組下降，但在神經(jīng)病理變化較小的小腦中無明顯變化，這些說明右旋-天冬氨酸的降低可能參與NMDA受體功能下調(diào)及記憶喪失的過程。Hasanein等[17]則發(fā)現(xiàn)AD患者神經(jīng)受損區(qū)具有特異性，Aβ25-35 在AD患者腦內(nèi)堆集、產(chǎn)生神經(jīng)毒性可能是通過NMDA受體促進(jìn)氧自由基的生成所引起的[18]，所以該實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)NMDA受體含量變化，推測(cè)抗氧化藥物白藜蘆醇是否對(duì)癡呆大鼠有作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著TR劑量的增加，海馬組織NMDA受體的表達(dá)減少，癡呆癥狀有所改善，TR對(duì)癡呆大鼠海馬起到保護(hù)作用，TR對(duì)大腦海馬的保護(hù)作用可能是通過下調(diào)海馬中NMDA受體NR1及N2A的表達(dá)完成的，但其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

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（收稿日期：2014-06-24）