摘要：為研究二氫吡啶抗奶牛熱應(yīng)激的作用機(jī)理，以20頭中國(guó)荷斯坦牛為材料，分別飼喂含0、100、150、200 mg/kg的二氫吡啶日糧，利用實(shí)時(shí)定量（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)其外周血淋巴細(xì)胞HSP70基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，日糧中添加二氫吡啶在高溫?zé)釕?yīng)激期可以顯著提高中國(guó)荷斯坦牛HSP70的表達(dá)量，其中日糧中添加200 mg/kg組表達(dá)量最高，顯著高于對(duì)照組和100 /mg/kg添加組（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：HSP70基因； 二氫吡啶；實(shí)時(shí)定量RT-PCR

中圖分類號(hào)：S816.79 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2014）10-0021-03

二氫吡啶（Diludin，2，6-二甲基-3，5-二乙基-1，4-二氫吡啶）是一種具有天然抗氧化劑維生素E的部分作用的新型多功能添加劑，具有抗氧化、提高血清SOD的活性、改變血清中激素水平等作用[1-5]。另外，孫燕燕等[6]通過(guò)二氫吡啶對(duì)小鼠熱應(yīng)激的影響研究表明，二氫吡啶在緩解小鼠熱應(yīng)激引起的生理?yè)p傷方面有一定的作用。張峰等[7]通過(guò)在奶牛日糧中添加二氫吡啶研究表明，二氫吡啶可以緩解夏季奶牛熱應(yīng)激對(duì)生產(chǎn)性能等指標(biāo)造成的影響。

奶牛熱應(yīng)激是指奶牛受到超過(guò)自身體溫調(diào)節(jié)能力的過(guò)高溫度刺激時(shí)，引起機(jī)體產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)，是導(dǎo)致奶牛夏季產(chǎn)奶性能、繁殖性能、免疫能力下降、造成奶牛死亡的主要原因之一[8-10]。熱應(yīng)激與一類具有重要生理功能和高度保守的多肽類蛋白質(zhì)熱應(yīng)激蛋白（Heat shock protein，HSP）有關(guān)，該類蛋白最初在熱處理果蠅中首次發(fā)現(xiàn)[11]。研究表明[7]HSPs在熱耐受形成過(guò)程中維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用[12]；Gabrief等[13]在對(duì)肉雞的熱應(yīng)激中發(fā)現(xiàn)HSP70 mRNA表達(dá)量在35 ℃3 h達(dá)到最高值；有研究者在給處于熱應(yīng)激的大鼠口服中藥制劑后發(fā)現(xiàn)添加中藥制劑后可以調(diào)節(jié)應(yīng)激大鼠后胃黏膜組織中的HSP70的表達(dá)[14]。

因此，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究不同溫度條件下飼料中添加不同劑量二氫吡啶對(duì)奶牛血液中HSP70基因表達(dá)的影響，以初步探討二氫吡啶抗熱應(yīng)激的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇處于相同胎次，相同泌乳階段的健康奶牛20頭，隨機(jī)分為4組，每組5頭。

采樣時(shí)間：根據(jù)日平均氣溫指數(shù)（THI）為85（高溫期）、71.3（臨界高溫期）和58.2（適溫期）時(shí)分別頸靜脈采集全血10 mL于EDTA抗凝采血管中，置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。

THI計(jì)算公式：THI=（1.8×Ta+32）-（0.55-0.55×RH）×（1.8×Ta-26） ，其中Ta為環(huán)境溫度，RH為相對(duì)濕度[15]。

1.2 飼喂方法

預(yù)飼期：10～15 d，正飼期：3個(gè)月。

飼喂：奶牛采取舍飼半拴系飼養(yǎng)，全混合日糧進(jìn)行飼喂，將二氫吡啶與0.4 kg 精料補(bǔ)充料混勻后分3 次單獨(dú)添加進(jìn)行飼喂，每天喂料結(jié)束后散放到運(yùn)動(dòng)場(chǎng)自由運(yùn)動(dòng)，飲水槽保證足夠清潔的飲水。試驗(yàn)期內(nèi)固定專人負(fù)責(zé)奶牛飼喂、奶牛管理、采樣并記錄THI數(shù)據(jù)。

各試驗(yàn)組二氫吡啶添加量：對(duì)照組、試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2、試驗(yàn)組3分別為0mg、100mg、150mg、200 mg/kg。

1.3 主要試劑與儀器

血液總RNA快速提取試劑盒；2×SYBR premix EXTaq TM；實(shí)時(shí)定量PCR儀。

1.4 血液總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

血液總RNA提取：采用上海生工血液總RNA快速提取試劑盒進(jìn)行總RNA提取，提取后進(jìn)行純度檢測(cè)。每個(gè)試驗(yàn)個(gè)體RNA單獨(dú)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為10 μL，其中總RNA 6.5uL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL、5×PrimeScript Buffer 2 μL、Random primers（引物）0.5μL、Oligo dT Primer（引物）0.5 μL。

1.5 實(shí)時(shí)定量引物設(shè)計(jì)

為避免基因組DNA污染干擾，根據(jù)跨內(nèi)含子原則進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)合成HSP70引物序列為：上游5′- GGAAACCACCCGTTAGTGC - 3′；下游5′- CTGCCAATCCAACAACCTCTT- 3′。內(nèi)參基因?yàn)棣?Actin，引物序列為：上游5′- GTCACCAACTGGGAC GACA -3′；下游5'-AGGCGTACAGGTGACAGCA -3'，引物由上海生工合成。

1.6 實(shí)時(shí)定量分析

采用SYBR Green I熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR擴(kuò)增的檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中2×SYBR premix EX TaqTM 10 μL、上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L）、cDNA 2 μL、ddH2O 7.2 μL。在實(shí)時(shí)定量PCR儀中同時(shí)進(jìn)行HSP70和β-Actin的PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s；61 ℃退火15s；72 ℃延伸10 s；45個(gè)循環(huán)后；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)過(guò)程中以高純水替代cDNA作為陰性對(duì)照。

HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔCT進(jìn)行計(jì)算[16]，ΔCT= CTHSP70- CTβ-Actin。

1.7 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性檢驗(yàn)

通過(guò)分析熔解曲線和取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳（100 v，15 min）確定擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，進(jìn)而確定PCR產(chǎn)物是否為目標(biāo)片段。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

利用Prism 5軟件進(jìn)行單因子方差分析比較不同溫度時(shí)期，同一處理組；相同溫度時(shí)期，不同處理組組間的HSP70的相對(duì)表達(dá)豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物特異性

擴(kuò)增曲線表明擴(kuò)增效果良好，且R2≥0.98。經(jīng)熔解曲線分析，HSP70（圖1）和β-Actin（圖2）分別在89 ℃和88.5 ℃出現(xiàn)單一產(chǎn)物峰，均與引物設(shè)計(jì)后預(yù)期產(chǎn)物Tm值相同。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，HSP70 和β-Actin組均出現(xiàn)與目的片段大小吻合的片段，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶。表明PCR產(chǎn)物分別為HSP70和β-Actin目的基因產(chǎn)物（圖3）。

圖1 HSP70的擴(kuò)增效率曲線

圖2 β-Actin的擴(kuò)增效率曲線

2.2 不同溫度時(shí)期定量分析

對(duì)照組、試驗(yàn)組HSP70表達(dá)量均隨溫度的升高而增加，其中試驗(yàn)組3在高溫期表達(dá)量最高，4個(gè)分組在適溫期HSP70的基因表達(dá)水平遠(yuǎn)低于高溫期，說(shuō)明HSP70基因在奶牛熱應(yīng)激過(guò)程中參與了其分子水平的調(diào)控（圖4）。

2.3 不同處理組間定量結(jié)果分析

適溫期、臨界高溫期HSP70基因表達(dá)水平在各組間差異不顯著。高溫期HSP70基因表達(dá)水平，試驗(yàn)組1、對(duì)照組與試驗(yàn)組3差異極顯著（P<0.01），試驗(yàn)組2與對(duì)照組差異顯著（P<0.05），其他各組間差異不顯著（圖4），說(shuō)明在日糧中添加200 mg/kg二氫吡啶可以顯著提高奶牛HSP70的表達(dá)量，從而緩解奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)。

3 小結(jié)與討論

對(duì)于血液樣品來(lái)說(shuō)，存在起始材料數(shù)量、提取RNA效率、反轉(zhuǎn)錄效率、目的基因擴(kuò)增效率不一致的情況，因此本研究選用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析的相對(duì)定量方法，通過(guò)設(shè)定內(nèi)參基因β-Actin校正差異，從而獲得HSP70基因表達(dá)的相對(duì)變化。

熱應(yīng)激蛋白按其分子量大小分為HSP110、HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSPS及泛素，其中最重要的是HSP70[17]。研究發(fā)現(xiàn)HSP70與環(huán)境溫濕度變化密切相關(guān)，在奶牛熱耐受中起著主要作用[18，19]，大量研究表明，HSP70是機(jī)體接觸高溫或其他刺激時(shí)表達(dá)最強(qiáng)的一種熱應(yīng)激蛋白[20，21]。本試驗(yàn)表明，中國(guó)荷斯坦牛由適溫期逐漸轉(zhuǎn)向高溫期的過(guò)程中，血液淋巴細(xì)胞均可表達(dá)HSP70，并且隨著熱應(yīng)激程度的提高HSP70的表達(dá)量增加，這與Mosser DD等的研究結(jié)果一致[22，23]。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛日糧中添加二氫吡啶，可以提高HSP70 mRNA水平的表達(dá)量，其中添加200 mg/kg日糧組提升效果最明顯，這可能與二氫吡啶的抗氧化功能有關(guān)，可以與胞色素P-450結(jié)合形成復(fù)合體，從而抑制NADPH-細(xì)胞色素C還原酶的活性，隔斷微粒體電子輸送NADPH酶的活性，抑制脂類化合物的過(guò)氧化，清除自由基，對(duì)生物膜起到抗氧化和保護(hù)作用，同時(shí)提高生物膜中6-磷酸葡萄糖酶的活性，穩(wěn)定生物細(xì)胞組織，促進(jìn)動(dòng)物新陳代謝[24，25]，從而提高HSP70的表達(dá)量，提高中國(guó)荷斯坦牛的抗熱應(yīng)激能力。

本研究初步證明二氫吡啶對(duì)HSP70具有表達(dá)調(diào)控作用，為我們進(jìn)一步開(kāi)展二氫吡啶抗奶牛熱應(yīng)激機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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