摘 要：為制備抗3α-HSD蛋白單克隆抗體（MAb），以已表達(dá)純化的高純度3α-HSD 蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)，經(jīng)過免疫和細(xì)胞融合后篩選出特異性的抗3α-HSD蛋白單克隆抗體，成功凍存35株IgG類型陽性雜交瘤細(xì)胞株。對14號和20號Anti- 3α-HSD進(jìn)行親和性測試，發(fā)現(xiàn)其與可溶性抗原蛋白的親和常數(shù)分別為3.7E+09和4.2E+09，二者可與抗原牢固結(jié)合，具有良好的親和性。

關(guān)鍵詞：3α-HSD；單克隆抗體；制備；鑒定

中圖分類號：R392.11 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.0074

睪丸酮叢毛單胞菌在含有類固醇的培養(yǎng)基上或環(huán)境中存在類固醇底物誘導(dǎo)時(shí)，可產(chǎn)生多種類固醇脫氫酶和11種降解酶，其中3α-HSD（3α-hydroxysteroid dehydrogenase， 3α-HSD）是一種能夠利用分解甾體類和多環(huán)芳烴類化合物來獲取菌體生長所需要的碳源和能源的關(guān)鍵酶。3α-HSD的中文全稱是3α羥基類固醇脫氫酶，目前認(rèn)為，3α-HSD不僅是睪丸酮叢毛單胞菌在以類固醇為唯一碳源時(shí)產(chǎn)生的一種醇脫氫酶，也是降解類固醇的關(guān)鍵酶，廣泛地存在于原核和真核生物體內(nèi)，是人體調(diào)節(jié)性激素代謝水平的重要物質(zhì)[1-4]。

在睪丸酮叢毛單胞菌降解甾醇類化合物類固醇的過程中，隨著甾體類激素等誘導(dǎo)劑濃度的提高，3α-HSD的翻譯表達(dá)量相應(yīng)提高，在一定范圍內(nèi)與甾體類激素含量形成了線性關(guān)系[5]?；谶@種間接的線性關(guān)系，可利用3α-HSD單克隆抗體，實(shí)現(xiàn)對環(huán)境或食品飼料樣品中睪丸酮或類固醇類激素的準(zhǔn)確定性以及定量檢測。研制3α-HSD單克隆抗體，可推動這種新型甾體激素檢測方法更為廣泛地用于監(jiān)測環(huán)境中甾體激素污染的整體情況，以及食物、飼料中類固醇類有害成分的快速初篩。目前，國內(nèi)外尚無針對睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD酶蛋白單克隆抗體制備的報(bào)道，本研究利用已表達(dá)純化的高純度3α-HSD 蛋白，通過免疫技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)，制備其單克隆抗體，為建立甾體類激素的快速檢測方法及睪丸酮叢毛單胞菌降解類固醇類物質(zhì)的機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

IMDM培養(yǎng)基、IMDM完全培養(yǎng)基（含15%血清）、新生牛血清為實(shí)驗(yàn)室保存；2.2%甲基纖維素（貨號：M0262-100G）、HAT（貨號：H0262-10V）、HT（貨號：H0137-10VL）購自SIGMA公司；PEG1500購自Roche公司（貨號：78364）；標(biāo)記山羊抗小鼠IgG/HRP購自中杉金橋公司（貨號：72324）；二篩和三篩所用包被抗體和各型亞類二抗抗體試劑購自Southern Biotech公司。標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)購自上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司。6～8周齡雌性BSPF級Balb/c雌性小鼠購自北京華大基因公司。

1.2 方 法

1.2.1 抗原檢測 對課題組已原核表達(dá)和純化的睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE質(zhì)控檢測，電泳條件為丙烯酰胺12%；濃縮膠恒壓80 V；分離膠恒壓100 V；考馬斯亮蘭染色60 min；脫色30 min后觀察檢測結(jié)果。

1.2.2 免疫 選用4只BALB/c雌性小鼠， 8周齡，20 g左右。用通過質(zhì)控的3α-HSD融合蛋白，每只小鼠按60 μg蛋白的量，皮下初次免疫4只SPF Balb/c雌性小鼠，編號為：1，2， 3，4。14 d后，皮下第1次加強(qiáng)免疫，免疫量為30 μg·只-1。28 d后，皮下第2次加強(qiáng)免疫，免疫量為30 μg·只-1。42 d后，皮下第3次加強(qiáng)免疫，免疫量為30 μg·只-1。50 d后，眼眶取血，測多抗血清效價(jià)。

1.2.3 效價(jià)檢測 將抗原蛋白溶于2 g·mL-1醋酸鹽包被緩沖液，4 ℃包被過夜；1%BSA， 37 ℃封閉2 h；多抗血清從200倍開始2倍梯度稀釋，空白對照（blank）為PBS，陰性對照（negative）為陰性血清200倍稀釋。用分光光度計(jì)讀取OD值，選取效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行融合試驗(yàn)60 d。

1.2.4 細(xì)胞融合 將狀態(tài)良好的sp2/0細(xì)胞與末次免疫后3 d所取的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合， 融合方法采用PEG法。將狀態(tài)良好的sp2/0細(xì)胞輕柔地從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來，吸入到50 mL離心管中。小鼠摘眼球取血，然后拉頸處死，放入75%的酒精中浸泡5 min。在平皿中倒入少量無血清的IMDM，將細(xì)胞篩及注射器內(nèi)芯放入平皿中。用剪刀和鑷子取下小鼠的脾臟，放到細(xì)胞篩上。用注射器的內(nèi)芯輕輕地將脾充分碾碎，將碾好的細(xì)胞吸入到裝sp2/0的離心管中，1 500 r·min-1離心5 min。用剪刀和鑷子取下小鼠的胸腺，碾碎。將碾好的胸腺細(xì)胞到15 mL離心管中，再加入1 mL的HAT，放在孵箱中備用。將離心好的細(xì)胞，倒掉上清，用無血清的IMDM將細(xì)胞小心輕柔地吹勻，離心（1 500 r·min-1，5 min）。將離心好的細(xì)胞上清盡量倒掉。拍打離心管底以充分懸浮細(xì)胞，將離心管放入37 ℃溫水中，在1 min內(nèi)緩慢加入1 mL的PEG，加完后，在溫水中靜置1 min。然后2 min內(nèi)緩慢加入2 mL的無血清的IMDM，接著2 min內(nèi)緩慢加入8 mL無血清的IMDM。1 000 r·min-1離心5 min。倒掉上清，加入10 mL的血清，小心地將細(xì)胞吹勻，倒入前面準(zhǔn)備好的胸腺細(xì)胞。再加入25 mL滅過菌的半固體培養(yǎng)基，充分混勻。然后均勻倒入30個細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入濕盒中，然后放入孵箱中培養(yǎng)。挑單克?。禾?0×93個細(xì)胞單克隆，培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（事先用胸腺細(xì)胞鋪板，100 μL·孔-1）。

1.2.5 細(xì)胞篩選 單克隆細(xì)胞第1次篩選：篩選用試劑主要包括：包被液，碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH值9.6；PBS緩沖液，pH值7.4；封閉液，1%BSA in PBS；洗液，PBS-T（0.05%吐溫，PBS）；顯色液，1%A液+10%B液（A液，1%TMB in DMSO； B液，0.1% H2O2 in 檸檬酸緩沖液）；終止液，2 mol·L-1硫酸；二抗，山羊抗小鼠IgG/HRP。

具體篩選流程包括以下步驟：用包被液稀釋3α-HSD，終濃度為10 μg·mL-1，100 ·L·孔-1，4 ℃，過夜，后用洗液洗滌2次。1%BSA封閉液封閉，200 μL·孔-1，37 ℃孵箱，2 h；后用洗液洗滌1次。加入一抗（細(xì)胞培養(yǎng)上清）、陰性對照（sp2/0培養(yǎng)上清）、空白對照（PBS）、陽性對照（陽性血清PBS 200倍稀釋），均為100 μL·孔-1，37 ℃孵箱，1 h；后用洗液洗滌3次。加入PBS稀釋20 000倍的二抗，100 μL·孔-1，37 ℃孵箱，1 h；取出后用洗液洗滌3次。顯色，顯色液100 μL·孔-1，顯色時(shí)間為5 min左右。每孔加入50 μL終止液終止。雙波長（450，603）測吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)。

單克隆細(xì)胞第2次篩選：單克隆細(xì)胞標(biāo)簽篩選，將一篩得到的陽性細(xì)胞株，載體蛋白包板，同時(shí)篩IgG，采用ELISA方法，得到二篩陽性雜交瘤細(xì)胞株。

單克隆細(xì)胞第3次篩選：主要試劑包括，包被抗體（Southern Biotech）；封閉液，2%BSA+3%蔗糖 in PBS；顯色液， 0.2 mL A液+ 10 μL30% H2O2 in 10 mL B液（A液，15 mg·mL-1 ABTS in H2O； B液，檸檬酸緩沖液，pH值4.0）；各型亞類二抗（Southern Biotech）。將篩選出來的二篩陽性細(xì)胞株進(jìn)行3篩鑒定，最后得到三篩陽性雜交瘤細(xì)胞株。

1.2.6 單克隆細(xì)胞亞類鑒定 將經(jīng)3次篩選出來的陽性細(xì)胞株進(jìn)行亞類鑒定，主要試劑包括：包被抗體（Southern Biotech ）；封閉液，2%BSA+3%蔗糖 in PBS；顯色液，0.2 mL A液+ 10 μL 30% H2O2 in 10 mL B液（A液，15 mg·mL-1 ABTS in H2O； B液，檸檬酸緩沖液，pH值4.0）；各型亞類二抗（Southern Biotech）。具體鑒定步驟如下：用100 mmoL·L-1 PBS（pH值7.4）稀釋包被抗體至0.5 μg·mL-1，每孔加0.1 mL， 4 ℃，過夜。PBS-T洗2次，每孔加入200 μL封閉液，37 ℃孵育2 h。PBS-T洗3次；每孔加入100 μL雜交瘤上清，37 ℃孵育1 h。PBS-T洗3次；用封閉液1∶1 000（κ，λ）或1∶2 000（其它的）稀釋的HRP標(biāo)記的抗體0.1 mL每孔，分別加入適當(dāng)?shù)目字校?7 ℃孵育1 h。PBS-T洗3次；每孔加50 μL底物溶液，10～20 min內(nèi)于雙波長（450，603）測吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)。

1.2.7 抗體的純化及檢測 采用Protein A/G親和純化，先用PBS平衡柱子，上樣（按1∶10的比例用PBS稀釋的腹水），用PBS洗雜，再用甘氨酸緩沖液（pH值2.9）洗脫，收集洗脫峰，用SDS-PAGE分析。紫外分光光度計(jì)檢測抗體濃度，SDS-PAGE檢測抗體純度。

1.2.8 ELISA檢測抗體親和力 將原核表達(dá)的3α-HSD蛋白樣品，以MAb （1∶2 000）為一抗，HRP-IgG為二抗（1∶2 000）進(jìn)行ELISA檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原檢測

對課題組已研制的高純度3α-HSD蛋白樣品進(jìn)行質(zhì)控檢測，電泳圖譜顯示其分子量為26 kD與課題組已發(fā)表文章中的數(shù)據(jù)一致（圖1），其純度大于90%，濃度為0.5 mg·mL-1（表1），說明蛋白在運(yùn)輸及傳遞和保存過程中并未出現(xiàn)明顯降解情況，其純度和濃度條件均符合單克隆抗體制備要求。

2.2 免疫及效價(jià)檢測

利用分光光度計(jì)檢測各個稀釋倍數(shù)的OD值，具體數(shù)值見表2，經(jīng)計(jì)算后可得到1、2、3、4號小鼠的效價(jià)分別為25 600，128 000，25 600，12 800。其所對應(yīng)的OD值分別為0.934，0.932，0.853，0.760，比較后可以發(fā)現(xiàn)，1號和3號小鼠效價(jià)相同均為25 600，高于2號和4號小鼠的效價(jià)，而1號的OD值最高。另外，根據(jù)圖2可以看出，1號小鼠的多抗血清在大部分稀釋倍數(shù)時(shí)其OD值普遍高于其他3者，是較為理想的基礎(chǔ)材料，所以經(jīng)綜合比較，選擇1號作為融合實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞。

2.3 細(xì)胞融合及篩選結(jié)果

融合前，用3α-HSD50 μg，腹腔沖擊免疫1#鼠。將融合后的細(xì)胞轉(zhuǎn)到半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將半固體培養(yǎng)基上生長的單克隆挑到96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)和后續(xù)篩選。

2.3.1 第1次單克隆細(xì)胞標(biāo)簽篩選 用3α-HSD包板，對挑選的克隆采用ELISA方法，做第1次篩選，得到95株陽性雜交瘤細(xì)胞株。

2.3.2 第2次單克隆細(xì)胞標(biāo)簽篩選 將95株陽性的細(xì)胞株，載體蛋白包板，同時(shí)篩IgG，采用ELISA方法，做第2次篩選，得到39株陽性雜交瘤細(xì)胞株。

2.3.3 第3次單克隆細(xì)胞標(biāo)簽篩選 將篩選出來的50株陽性細(xì)胞株進(jìn)行3篩鑒定，最后得到39株IgG類型的陽性雜交瘤細(xì)胞株（表3）。

2.4 單克隆細(xì)胞亞類鑒定

將篩選出來的39株陽性細(xì)胞株進(jìn)行亞類鑒定，最后得到38株IgG類型的陽性雜交瘤細(xì)胞株。編號數(shù)值前帶“+”的為IgG亞類細(xì)胞株，均轉(zhuǎn)到6孔板擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清并凍存。最后，經(jīng)檢測，共成功凍存35株陽性雜交瘤細(xì)胞株。

2.5 抗體純化及檢測結(jié)果

單克隆抗體經(jīng)Protein A/G親和純化后，收集洗脫樣品。利用紫外分光光度計(jì)檢測抗體濃度，利用SDS-PAGE檢測抗體純度。結(jié)果顯示（表4，圖3），14號Anti- 3α-HSD和20號Anti- 3α-HSD的純度全部大于90%，濃度分別達(dá)到4.37 mg·mL-1和2.88 mg·mL-1。

2.6 抗體親和力（親和常數(shù)）檢測

將原核表達(dá)的3α-HSD蛋白樣品，以MAb （1∶2 000）為一抗，HRP-IgG為二抗（1∶2 000）進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果如圖4。14號Anti- 3α-HSD和20號Anti- 3α-HSD與可溶性抗原蛋白的親和常數(shù)分別為3.7E+09和4.2E+09，二者可與抗原牢固結(jié)合，具有良好的親和性和均一性，可用于3α-HSD蛋白及攜有抗原3α-HSD蛋白成分的樣品免疫檢測。

3 結(jié)論與討論

在睪丸酮叢毛單胞菌降解甾醇類化合物類固醇的過程中，甾體類誘導(dǎo)劑的加入可全面抑制阻遏蛋白Rep B和3α-HSD基因mRNA的結(jié)合及Rep A與順式操縱子雙位點(diǎn)的結(jié)合，從而促進(jìn)3α-HSD基因的表達(dá)和翻譯過程的順利進(jìn)行。隨著甾體類激素等誘導(dǎo)劑濃度的提高，阻遏蛋白的被抑制程度也隨之增加，而3α-HSD的翻譯表達(dá)量相應(yīng)提高，在一定范圍內(nèi)與甾體類激素含量形成了線性關(guān)系。研究人員利用3α-HSD單克隆抗體，以C. testosterone作為檢測環(huán)境中載體類化合物的指示菌種，以3-HSD為目標(biāo)蛋白建立了環(huán)境或食品中總甾體激素含量的雙抗夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)（ ELISA）[6-7]。雙抗夾心ELISA法具有操作簡便、靈敏度高和通亮高等特點(diǎn)，可以同時(shí)檢測睪丸酮及與其結(jié)構(gòu)類似的一類物質(zhì)的量，可用于監(jiān)測環(huán)境中甾體激素污染的整體情況和食物、飼料中類固醇類有害成分的快速初篩。此次3α-HSD單克隆抗體的研制成功將為這種新型甾體激素檢測方法的進(jìn)一步研究和推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Boyer J， Baron D N， Talaly P. Purification and properties of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase[J].Biochemistry， 1965， 4 （19） ： 1 825-1 833.

[2] Mobus E， Maser E. Molecular cloning， overexpression and characterization of steroid-inducible 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosterone，a novel member of the short-chain dehydrogenase/reductase superfamily[J]. J Biol Chem，1998，273 （473）：30 888-30 896.

[3] Xiong G， Martin H J， Blum A， et al. A model on the regulation of 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase expression from Comamonas testosterone[J].J Biol Chen，276（130/132）：961-970.

[4] 弓玉紅，郝林，郭凱凱.1株苯并[a]芘高效降解菌的分離鑒定[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（5）：490-492.

[5] Mobus E，Jahn M，Schmid R，et a1. Testosterone-regulated expression of enzymes involved in steroid and aromatic hydrocarbon catabolism in comamonas testosteroni[J]. J Bacteriol， 1997，179（18）：5 951-5 955.

[6] Yu Y H，Diao Y W，Ma D Z，et a1. Expression and contection of 3-HSD in different bacteria by the induction of testosterone[J]. Journal of Changchun University of Science and Technology：Natural Science Edition，2007，30（4）：63-65.

[7] Ma D Z，Diao Y W， Yang J X，et a1. ELISA detection of steroidal hormones in water resources，food and feed[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry， 2010，27（12）：1 466-1 469.