摘 要：以喀什蕪菁為材料，利用顯微鏡技術(shù)，研究小孢子胚胎發(fā)生過程。試驗結(jié)果表明，沒有進行熱激處理的小孢子主要是沿配子體途徑發(fā)育，即從四分體，經(jīng)由單核靠邊期、雙核期，發(fā)育成為成熟的花粉粒過程；33℃熱激處理1～3 d后，小孢子改變發(fā)育途徑，沿孢子體途徑發(fā)育。部分小孢子出現(xiàn)細胞膨大，發(fā)生第一次有絲分裂分裂，形成2—細胞，2個子細胞之一發(fā)生垂直于子細胞壁方向的分裂， 形成“T”型3—細胞原胚然后沿多細胞原胚、胚柄球形胚、魚雷形胚、心形胚最終發(fā)育成子葉型胚。但隨培養(yǎng)天數(shù)增加，大多數(shù)膨大的細胞不能分裂或分裂后停止發(fā)育。

關(guān)鍵詞：蕪菁；小孢子培養(yǎng)；胚胎發(fā)育

中圖分類號： Q942 文獻標識碼： A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.003

游離小孢子培養(yǎng)是產(chǎn)生雙單倍體的方法之一，對加快十字花科蔬菜植物的雜交育種速度，提高育種效率具有重要作用。不同物種小孢子胚胎發(fā)生途徑受基因型[1]、低溫[2]、小孢子發(fā)育階段[3]等很多內(nèi)外因素的影響。小孢子正常發(fā)育方向是通過不對稱核分裂后發(fā)育成花粉，而要讓小孢子發(fā)育成胚，就要阻斷原有的配子體發(fā)育方向，使小孢子進行對稱性分裂向孢子體方向發(fā)育，即對稱分裂才能誘導(dǎo)小孢子胚發(fā)生[4]。外界脅迫被認為是誘導(dǎo)小孢子從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑的關(guān)鍵因子，并使其發(fā)生均等分裂。目前比較常用的脅迫方式有熱激預(yù)處理、低溫預(yù)處理、饑餓預(yù)處理和秋水仙素預(yù)處理及高pH值等[1，3，5-6]。其中以熱激處理最為常見。小孢子經(jīng)適當?shù)臒峒づ囵B(yǎng)后，獲得胚性，隨之細胞內(nèi)發(fā)生一些特有的形態(tài)學(xué)變化，如細胞核向中央移動、液泡破裂和細胞膨大等。劉公社等[7]和姜立榮等[4]對大白菜小孢子培養(yǎng)中熱激與非熱激處理后小孢子分裂方式變化以及細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)進行了觀察，揭示了小孢子胚胎發(fā)生過程中的形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)變化。李菲等[8]通過DAPI熒光染色觀察大白菜游離小孢子胚胎發(fā)生過程，發(fā)現(xiàn)大白菜小孢子以均等分裂途徑為主要發(fā)育途徑，胚胎發(fā)生的啟動機制是熱激誘導(dǎo)下，單倍體小孢子體積膨大，染色體自然加倍，從而激發(fā)小孢子進入孢子體發(fā)育途徑。筆者對蕪菁小孢子進行分別培養(yǎng)，即未進行熱激處理培養(yǎng)和熱激培養(yǎng)，顯微觀察發(fā)現(xiàn)熱激確實改變了小孢子的發(fā)育途徑，但具體機理和過程仍需進一步探討。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料為新疆喀什地區(qū)廣泛種植的蕪菁。

1.2 方 法

1.2.1 蕪菁小孢子培養(yǎng)及熱激處理 2013年3月，將喀什蕪菁肉質(zhì)根定植于直徑為30 cm的花盆中，給予正常的田間管理。4月11日，部分蕪菁開始抽薹。待植株現(xiàn)蕾，于始花期，選取5～10個花序置于冰盒，選擇長度為1.0～1.99，2.0～2.49，2.5～2.99 mm的花蕾。每一級別取15～20個花蕾，用2%NaOCl沖洗10 min后用無菌水沖洗3次，然后用注射器活塞的底部旋轉(zhuǎn)壓榨花蕾3圈半，加4 mL的NLN-13的培養(yǎng)基提取小孢子，然后用冷凍離心機離心3次，轉(zhuǎn)速為800 r·s-1。倒掉上清，留取沉淀。將沉淀用1 mL的NLN-13培養(yǎng)基配制成懸浮液，用血球計數(shù)板調(diào)整小孢子密度為104個·mL-1。然后將裝有小孢子懸浮液的培養(yǎng)皿置于33 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)1～3 d后，最后于25 ℃暗培養(yǎng)，直至出胚。

1.2.2 DAPI熒光染色及顯微觀察 與上述同期，選取5～10個花序置于冰盒，摘取花蕾，將花蕾分為1.0～1.99，2.0～2.49，2.5～2.99 mm三級。每一級別取12～15個花蕾，花蕾經(jīng)消毒、研磨、分離純化后，按照小孢子培養(yǎng)的步驟進行計數(shù)、培養(yǎng)，不同的是，不進行熱激處理。每天提取1 mL的培養(yǎng)液，離心沉淀后，染色、制片，將制備好的切片置4 ℃冰箱內(nèi)，過夜，在顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAPI染色觀察蕪菁小孢子不經(jīng)熱激處理發(fā)育為成熟花粉粒的形態(tài)及核分裂特點

被子植物中，花粉常用于指2—細胞或3—細胞時期的雄配子體，為了與此區(qū)別，一般把從四分體釋放出來到形成成熟花粉之前的雄配子體稱為小孢子[4]。在顯微鏡下觀察可見，蕪菁的小孢子母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成4個單倍體的小孢子即四分體小孢子（圖1-2），當小孢子從四分體釋放后，進一步形成明顯的壁，同時體積迅速增大。隨著體積的增大，細胞核從中央移到細胞的一側(cè)，即單核靠邊期小孢子（圖1-4）。此后小孢子在正常的配子體發(fā)育途徑中經(jīng)歷兩次分裂，第1次分裂形成1個營養(yǎng)核和1個生殖核，稱為雙核期小孢子（圖1-5），同時兩核間形成弧形的細胞板，小孢子分裂為兩個高度不均等的細胞。第2次分裂即生殖核發(fā)生分裂形成2個精子，小孢子發(fā)育為具有1個營養(yǎng)核和兩2個精核的成熟花粉粒（圖1-6）。蕪菁單核期小孢子發(fā)育為成熟花粉粒，其外部形態(tài)和體積也相應(yīng)的發(fā)生明顯的改變，這為蕪菁游離小孢子培養(yǎng)選取適宜發(fā)育階段的小孢子提供了可靠的形態(tài)依據(jù)。

2.2 蕪菁花粉小孢子細胞的膨大與分裂

對大多數(shù)物種來說，適合誘導(dǎo)雄核發(fā)育的花粉發(fā)育時期，是在單核小孢子第1次有絲分裂即將開始、正在進行或剛剛結(jié)束的時候[9]。本試驗選取2.0～2.49 mm長的花蕾，分離小孢子進行培養(yǎng)。該長度的花粉小孢子大多處于單核靠邊期，經(jīng)33 ℃熱激處理，易于改變發(fā)育方向，使得花粉小孢子沿著孢子體途徑發(fā)育。熱激培養(yǎng)1 d后觀察，大多數(shù)細胞出現(xiàn)明顯膨大。2 d后膨大的細胞開始分裂，而未明顯膨大的細胞一般不發(fā)生分裂。同期觀察的情況下，分裂的細胞數(shù)大大少于膨大的細胞數(shù)，這說明分裂僅發(fā)生在少部分膨大的小孢子中，這也印證余鳳群等[10]關(guān)于小孢子培養(yǎng)后細胞的膨大是其分裂的先兆的觀點。蕪菁小孢子先是分裂1次，隨后部分細胞進行多次分裂，直至最后形成子葉型胚（圖2-9）。觀察發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中，大多數(shù)細胞停留在2—細胞（圖2-2）、3—細胞階段，即T—細胞（圖2-3）階段，不再繼續(xù)發(fā)育，出現(xiàn)多種細胞形態(tài)并存的現(xiàn)象。本試驗最后只得到一個子葉型胚，出胚率僅有1/25（胚/蕾）。由此推斷，隨著培養(yǎng)的進行，部分膨大和分裂的細胞可能發(fā)育受阻失去了活力。

2.3 蕪菁小孢子胚胎發(fā)育過程

游離的蕪菁小孢子懸浮于NLN-13培養(yǎng)基中，經(jīng)33 ℃恒溫培養(yǎng)箱熱激培養(yǎng)48 h后，觀察發(fā)現(xiàn)部分小孢子膨大，直徑明顯大于未激活的小孢子（圖2-1），且個別膨大細胞已經(jīng)開始第一次分裂。隨后在24 ℃下靜置培養(yǎng)，具有胚狀體發(fā)生能力的小孢子，分裂形成2—細胞原胚。該原胚的2個子細胞大小相近。隨后，2個子細胞之一先發(fā)生垂直于子細胞壁方向的分裂， 形成“T”型3—細胞原胚，并繼而發(fā)生垂直于平行方向的分裂，形成多細胞團的胚狀體部分。2—細胞原胚中的另一子細胞分裂較慢，一般發(fā)生平行方向分裂形成胚柄。在小孢子培養(yǎng)將近15 d后，胚狀體一般發(fā)育成近似于圓球狀或橢圓形且攜帶著胚柄。胚的主體部分顯著大于胚柄部分，且細胞小而排列緊密。隨著胚狀體的進一步生長，胚頂端子葉原基分化而使胚狀體呈心形，此時胚柄大多已脫落并游離到液體培養(yǎng)基中。隨著子葉和胚軸細胞的繼續(xù)分裂，胚體積不斷增大而發(fā)育成魚雷胚。極少數(shù)細胞多次分裂形成球型胚（圖2-6，2-7）、魚雷型胚、心型胚（圖2-8）和子葉型胚（圖2-9，2-10）。觀察發(fā)現(xiàn)，蕪菁小孢子胚胎發(fā)育的過程中存在著小孢子發(fā)育的不同步性。這與高海娜等[11]關(guān)于甘藍小孢子處于單核靠邊期的花粉小孢子在同等培養(yǎng)條件下胚胎群體中同時存在著各個時期的胚狀體觀點一致。

3 討 論

（1）本試驗在熱激培養(yǎng)1 d后，有2—細胞（圖2-2）出現(xiàn)，這2個子細胞，大小接近。推測蕪菁小孢子熱激培養(yǎng)后，第一次分裂方式為均等分裂，但這并不排除不均等分裂的可能性。早期研究指出，蕓薹屬蔬菜小孢子胚胎發(fā)育途徑既有對稱分裂的B途徑，也有不對稱分裂的A途徑[12]。劉公社等[7]、李菲等[8]研究發(fā)現(xiàn)白菜中小孢子游離培養(yǎng)的胚胎發(fā)育以B 途徑為主。張菊平等[13]在研究辣椒花藥培養(yǎng)時，得到多核花粉來源于單核小孢子的對稱分裂或不對稱分裂。試驗結(jié)果顯示，多數(shù)胚性花粉是通過不對稱的小孢子有絲分裂產(chǎn)生的早期雙核花粉中的營養(yǎng)核的分裂產(chǎn)生的。不結(jié)球白菜小孢子胚胎發(fā)生的過程及發(fā)育途徑研究表明，不結(jié)球白菜花粉母細胞減數(shù)分裂釋放出的小孢子發(fā)育到單核靠邊期及稍后時期染色最深、活力最強。多數(shù)游離小孢子培養(yǎng)經(jīng)歷的發(fā)育過程與合子胚相似，小孢子胚胎發(fā)育途徑既有核對稱分裂產(chǎn)生胚胎的途徑（B途徑），也有第1 次不對稱有絲分裂后營養(yǎng)細胞反復(fù)分裂單獨發(fā)育成胚的方式（A途徑）[14]。

（2）圖2-4，2-5類似胚柄的結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，意味著細胞在發(fā)育初期出現(xiàn)極性分化。很可能與小孢子的不均等分裂相關(guān)，有待進一步探討。這一現(xiàn)象說明同樣處在單核靠邊期的小孢子其生理狀況卻差異極大，這對發(fā)育的調(diào)控提出了更高的要求。李春玲等[15]對燈籠椒、牛角椒、羊角椒、線形椒和朝天椒等辣（甜）椒游離小孢子的培養(yǎng)與觀察表明：小孢子最初的細胞分裂有均等和不均等兩種方式，胚胎發(fā)生過程與合子胚發(fā)育過程極相似，直到心形胚以前均可觀察到胚柄的存在。

（3）游離小孢子在NLN-13液體培養(yǎng)基中發(fā)育的啟動時間極不一致，熱激培養(yǎng)3 d后可觀察到多種胚性小孢子共存，與此同時仍觀察到不少單核小孢子，它們可能繼續(xù)發(fā)育或已經(jīng)失去活性。余鳳群等[10]在油菜型甘藍小孢子的離體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)4～5 d后部分細胞已進行多次分裂，但仍有一些細胞停留在2—細胞、3—細胞階段，出現(xiàn)2—細胞、3—細胞與多細胞團并存的現(xiàn)象。然而從培養(yǎng)細胞的活力測定結(jié)果來看，培養(yǎng)4～5 d后小孢子的存活力顯著低于細胞膨大和分裂的細胞頻率，說明部分膨大或分裂的小孢子可能發(fā)育受阻而失去了活力。

（4）獲得小孢子胚狀體是蕪菁小孢子培養(yǎng)應(yīng)用于育種實踐的先決條件。從本試驗來看，只有極少數(shù)小孢子最終能發(fā)育成胚狀體。材料基因型是胚狀體產(chǎn)生的先決條件，其次就是胚胎誘導(dǎo)。誘導(dǎo)的方式有離心、低溫、高溫、射線、甘露醇等方法，目的是從生理生化上改變細胞生理狀態(tài)、改變其分裂方式和發(fā)育途徑[16-19]。試驗中常采用高溫進行誘導(dǎo)，效果相對較好。該方法被廣泛用于蕓薹屬植物的花藥培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)。栗根義等[20]研究表明，高溫預(yù)處理在白菜游離小孢子培養(yǎng)中也收到了良好的效果。試驗證明，接種后33～35 ℃，暗培養(yǎng)24 h，對胚狀體誘導(dǎo)的效果最為理想。周偉軍等[21]對油菜游離小孢子分別進行32 ℃和30 ℃熱擊暗培養(yǎng)3 d和7 d后轉(zhuǎn)入常溫（24 ℃）下培養(yǎng)，其胚胎發(fā)生好，產(chǎn)胚率高，獲得了大量正常胚體。結(jié)球甘藍游離小孢子經(jīng)過34 ℃處理48 h 后，許多小孢子開始膨大，第3 天就可看到第一次分裂，培養(yǎng)25～30 d 后可發(fā)育成不同時期的胚，25 ℃恒溫培養(yǎng)的小孢子沒有發(fā)生分裂現(xiàn)象，說明高溫?zé)峒ゎA(yù)處理是促進細胞對稱分裂，改變小孢子發(fā)育方向的主要條件[22]。為了提高小孢子胚產(chǎn)量，減少小孢子在通向胚狀體形成途徑的死亡，應(yīng)該改善分離小孢子的條件，或是通過改善培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法，以減少分離過程造成小孢子的死亡，提高小孢子有效膨大和分裂的比例。

4 結(jié) 論

本試驗在顯微鏡下觀察蕪菁游離小孢子熱激培養(yǎng)與小孢子正常發(fā)育為成熟花粉粒的過程，比較兩者在小孢子形態(tài)與核分裂方式的差別。結(jié)果顯示，單核靠邊期小孢子在不同發(fā)育途徑下其外部形態(tài)和細胞核分裂方式都發(fā)生了明顯改變：沿配子體途徑正常發(fā)育的小孢子從單核期到雙核前期，圓球形小孢子體積有所增大，但雙核后期小孢子即由圓球形變?yōu)闄E圓形。正常發(fā)育下單核小孢子發(fā)生不均等分裂，形成一個大的營養(yǎng)細胞，營養(yǎng)細胞內(nèi)包含一個小的生殖細胞；而誘導(dǎo)向孢子體途徑發(fā)育的小孢子，經(jīng)熱激啟動后小孢子仍保持圓球形，但體積明顯膨大，光學(xué)顯微鏡下觀察，啟動膨大的小孢子細胞先經(jīng)過一次分裂，形成大小相近的2—細胞，此后體積發(fā)生一系列分裂，最終形成胚狀體。由此可以初步判斷熱激啟動的小孢子孢子體發(fā)育途徑，單核小孢子變?yōu)槎扼w的單細胞。

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