摘 要：細(xì)胞自噬與植物生長、發(fā)育和逆境響應(yīng)等過程密切相關(guān)。本研究構(gòu)建了小麥重要自噬相關(guān)基因TaATG4a和TaATG8h的原核表達(dá)載體并導(dǎo)入大腸桿菌。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，兩個基因在大腸桿菌中均能夠高效表達(dá)，表達(dá)重組蛋白的分子量與預(yù)測分子量基本一致。利用Ni柱親和層析方法進(jìn)一步獲得了純度較高的重組蛋白，為今后的體外酶活分析、抗體制備和Western雜交等研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞自噬；小麥；ATG4；ATG8；原核表達(dá)

中圖分類號：S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.004

胞自噬（Cell autophagy）是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一種溶酶體（酵母、植物為液泡）依賴性降解途徑，用于凈化自身多余或受損細(xì)胞結(jié)構(gòu)和大分子、促進(jìn)生物大分子循環(huán)利用[1]。細(xì)胞自噬過程中，首先是批量細(xì)胞質(zhì)成分或細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)包圍，形成自噬小體（Autophagosome），隨后自噬小體外膜與溶酶體膜融合，將內(nèi)膜及包圍物質(zhì)（自噬小泡，Autophagic body）送入溶酶體腔進(jìn)行消化[2]。ATG4和ATG8是兩個重要自噬相關(guān)基因（Autophagy-related gene， ATG）。ATG8蛋白前體的C端經(jīng)具有半胱氨酸蛋白酶活性的ATG4酶切后暴露出保守的甘氨酸殘基。此后，ATG8經(jīng)一個類泛素結(jié)合系統(tǒng)與脂類物質(zhì)磷脂酰乙醇胺（PE）相連形成ATG8-PE。ATG8-PE定位于自噬膜上，對于自噬膜的裝配、延伸、合攏及與液泡的融合過程都具有重要意義。ATG4對ATG8的酶切加工是ATG8進(jìn)入類泛素連接系統(tǒng)的前提。ATG4又能從ATG8-PE和自噬膜上釋放ATG8，ATG8從自噬膜上的釋放是促進(jìn)自噬小體成熟并成為可融合形式的重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞自噬在進(jìn)化過程中高度保守。植物上，擬南芥基因組分析發(fā)現(xiàn)了36個ATG基因[3]，煙草[4]、水稻[5]、玉米[6]、大豆[7]和小麥[8]等作物上ATG基因的鑒定和分析也相繼被報(bào)道。擬南芥上的研究表明，ATG4和ATG8在植物細(xì)胞自噬中同樣扮演了與酵母類似的重要角色[9-10]。

細(xì)胞自噬與植物生長、發(fā)育及響應(yīng)多種生物、非生物脅迫，包括營養(yǎng)缺乏、氧脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫和病原侵染等的反應(yīng)過程密切相關(guān)[11]。到目前為止，有關(guān)細(xì)胞自噬的分子機(jī)理和生理功能研究仍然僅限于擬南芥等模式物種上，在重要農(nóng)作物尤其是小麥上的報(bào)道很少。本研究在前期成功克隆多個小麥重要ATG基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了ATG4和ATG8基因的原核表達(dá)載體，經(jīng)大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)和重組蛋白純化過程獲得了小麥ATG4和ATG8的純化重組蛋白，可為下一步體外酶活測定、抗體的制備和Western雜交等試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 基因和載體

小麥自噬相關(guān)基因TaATG4a和TaATG8h由本實(shí)驗(yàn)室（天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）克隆。兩個基因全長cDNA分別克隆于pGEM-Teasy載體上。原核表達(dá)載體pET30a由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)合成兩端添加NotⅠ識別位點(diǎn)的PCR引物對4aNOTI-F （ATAAGAATGCGGCCGCATGACGAGCTTGCCTGAGAG）/4aNOTI-R （ATAAGAATGCGGC CGCTCAGAGAATCTGCCACTCAT） 和8hNOTI-F（ATAAGAATGCGGCCGCATGAAGTCC TTCAAGAAGGA）/8hNOTI-R（ATAAGAATGCGGCCGCTCACCCAAATGTCTTCTCGC），使用pfu DNA聚合酶從pGEM-Teasy載體上分別擴(kuò)增TaATG4a和TaATG8h基因的全長ORF。擴(kuò)增產(chǎn)物NotⅠ-NotⅠ片段經(jīng)酶切、連接過程克隆到原核表達(dá)載體pET30a的NotⅠ位點(diǎn)處，測序鑒定正確插入方向（起始密碼子ATG緊鄰T7啟動子）的重組表達(dá)載體pET-ATG4a和pET-ATG8h。采用熱激法將表達(dá)載體導(dǎo)入到大腸桿菌BL21（DE3）中。

1.3 原核表達(dá)

接種含重組載體質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）到LBK液體培養(yǎng)基中（含50 mg·L-1卡那霉素），37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1%的比例擴(kuò)大到5 mL LBK液體培養(yǎng)基中（卡那霉素 50 mg·L-1），37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8。加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，于28 ℃條件下震蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)。分別于誘導(dǎo)后0，2，4，6，8 h取1 mL菌液用于總蛋白的SDS-PAGE電泳分析。

1.4 SDS-PAGE電泳

將1 mL菌液10 000 r·min-1離心10 min，棄上清后加入80 μL的ddH2O重懸沉淀，再加入20 μL電泳上樣緩沖液（5X）并混勻，沸水浴10 min。12 000 r·min-1離心5 min，取上清用SDS-PAGE凝膠電泳（13%分離膠，4%濃縮膠）分離蛋白。電泳后用考馬斯亮藍(lán)（R-250）染色液染色1 h，脫色液脫色至背景無色后觀察并拍照。

1.5 重組蛋白的純化

重組蛋白為N端含組氨酸標(biāo)簽His（6）的His（6）-TaATG4a或His（6）-TaATG8h，因此使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（康為世紀(jì)），在非變性條件下經(jīng) Ni 柱親和層析過程純化重組蛋白。層析柱的平衡、菌體的超聲波破碎和可溶性蛋白的上樣及雜蛋白的清洗等過程參照試劑盒手冊進(jìn)行。分別使用5 mL含50，100，200，300和500 mmol·L-1 咪唑的洗脫液分段洗脫目標(biāo)蛋白。收集各階段的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE（13%分離膠，4%濃縮膠）電泳和考馬斯亮藍(lán)（R-250）染色、脫色分析。純化的蛋白質(zhì)溶液（洗脫液）-80 ℃冰箱保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaATG4a和TaATG8h的原核表達(dá)

構(gòu)建了小麥TaATG4a和TaATG8h基因的原核表達(dá)載體。將表達(dá)載體pET-ATG4a和pET-ATG8h分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）菌株中。如圖1和2所示，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌總蛋白中目標(biāo)蛋白表達(dá)微弱。而經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)，兩個載體均正確表達(dá)出了重組蛋白His（6）-TaATG4a和His（6）-TaATG8h，實(shí)際分子量與理論分子量（His（6）-TaATG4a：59.25 kDa；His（6）-TaATG8h：20.22 kDa）基本一致。28 ℃培養(yǎng)條件下，His（6）-TaATG4a的表達(dá)量在誘導(dǎo)后0～8 h時間段內(nèi)隨誘導(dǎo)時間的延長逐漸增加（圖1），而His（6）-TaATG8h在誘導(dǎo)后2 h 即可實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)（圖2），且其表達(dá)量并未隨著時間的增加而有明顯的變化。電泳上樣樣品為大腸桿煮沸液的上清部分，表明兩個重組蛋白在可溶性部分中的表達(dá)量足夠高，滿足純化要求，這為后續(xù)非變性條件純化過程的選擇提供了依據(jù)。

2.2 小麥TaATG4a和TaATG8h重組蛋白的純化

鑒于目標(biāo)蛋白N端融合了His（6）組氨酸標(biāo)簽，采用Ni 柱親和層析方法純化總可溶性蛋白中的目標(biāo)蛋白。如圖3和4所示，流穿液中目的蛋白較少。經(jīng)由不同濃度咪唑洗脫液的洗脫，雜蛋白含量逐漸減少，目標(biāo)蛋白的相對含量逐漸增加。兩個目標(biāo)重組蛋白His（6）-TaATG4a和His（6）-TaATG8h的500 mmol·L-1咪唑洗脫液的純度較高，滿足抗體的制備要求。但洗脫液中目標(biāo)蛋白的含量較低，因此如果后續(xù)免疫工作中抗原量不足，可以選擇其他雜蛋白含量較低的咪唑濃度洗脫液進(jìn)行切膠后回收目標(biāo)條帶免疫或碎膠直接免疫的方法。

3 結(jié)論與討論

自噬是一種普遍的蛋白質(zhì)降解途徑，在植物新陳代謝和生長中扮演了重要角色，這些過程包括種子的發(fā)育、液泡的增大、饑餓條件下氮的循環(huán)、衰老、細(xì)胞凋亡和植物在生物、非生物脅迫下的響應(yīng)[11]，所以從包括ATG4和ATG8在內(nèi)的重要ATG基因入手，對自噬分子機(jī)制開展深入研究具有重要的生物學(xué)意義。

本研究采用pET30a大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行原核表達(dá)，該原核表達(dá)系統(tǒng)帶有T7噬菌體啟動子，能夠?qū)⒍嗑劢M氨酸標(biāo)簽融合入目的蛋白，此方法的優(yōu)點(diǎn)有易于純化、操作方便和表達(dá)量大等[12]。在pET30a表達(dá)載體上的T7啟動子能夠與大腸桿菌BL21（DE3）中噬菌體編碼的T7 RNA聚合酶特異性的結(jié)合，然后啟動T7啟動子下游的目標(biāo)基因的表達(dá)。T7 RNA聚合酶的活性很高，它的轉(zhuǎn)錄合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快很多，并且不經(jīng)常有終止轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象發(fā)生[13]。本研究中通過原核表達(dá)載體構(gòu)建、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和基于組氨酸標(biāo)簽的Ni柱親和層析過程獲得了純化的TaATG4a和TaATG8h重組蛋白。重組蛋白的獲得為今后抗體制備和通過免疫學(xué)方法深入研究TaATG4a和TaATG8h基因在小麥自噬過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。重組蛋白以可溶性形式存在，這使后續(xù)的蛋白純化過程可以在無變性劑的相對溫和條件下進(jìn)行，純化后的蛋白可以最大限度地保持其空間構(gòu)象與功能，便于以后的體外酶活分析研究。

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