摘 要：分子標(biāo)記技術(shù)是基于生物體基因組的遺傳分析方法，在植物的親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、分子輔助育種、品種鑒定等研究中已有廣泛應(yīng)用。其中微衛(wèi)星分子標(biāo)記（Simple sequence repeats，SSRs）技術(shù)作為一種新世紀遺傳學(xué)研究工具，以其信息量大，重復(fù)性好、可靠性高和多態(tài)性豐富等優(yōu)點，在植物遺傳育種研究中表現(xiàn)出很大的優(yōu)勢。本文簡要介紹了簡單重復(fù)序列（SSRs）標(biāo)記的分布、功能、技術(shù)優(yōu)缺點和產(chǎn)生多態(tài)性的機理，并對SSR標(biāo)記在植物遺傳多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位與克隆、分子標(biāo)記輔助育種等研究中的應(yīng)用情況進行了綜述，為植物資源利用、開發(fā)和保護等研究領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：SSR 分子標(biāo)記 遺傳多樣性 遺傳圖譜

Abstract：Molecular marker technology is a genetic analysis method based on organism genome，and is widely used in genetic relationship of plant analysis、genetic diversity and population structure research、genetic Linkage map、marker-assisted selection、species identification and other studies.Which microsatellite markers（Simple sequence repeats，SSRs）technology as a genetic research tool in the new century，with a great advantage in studies of genetics and breeding of plants due to its abundance information，good Repeatability，high reliability and high polymorphism，etc.The reviews has briefly clarified the distribution、function、advantages and disadvantages and Polymorphism Mechanism of SSR in plant genom，and summarized the application of SSR marker in the genetic diversity research、genetic linkage map const ruction、gene mapping and cloning、QTL analysis、molecular marker-assisted selection and so on.It has been commonly used for the utilizationdevelopment and protection of biological resources.

Key words：Microsatellites；Molecular marker；genetic diversity；genetic map.

1 引言

伴隨著遺傳學(xué)的發(fā)展， 遺傳標(biāo)記（genetic marker） 經(jīng)歷了形態(tài)標(biāo)（morphological maker）、細胞標(biāo)記（cytological maker）、生化標(biāo)記（biochemical maker）和分子標(biāo)記（molecular maker）四個階段[1]。其中DNA分子標(biāo)記的獨特優(yōu)勢在于它信息量大、在植物不同組織及不同發(fā)育時間均可以進行檢測[2]、多數(shù)標(biāo)記呈共顯性、經(jīng)濟方便和易于觀察記錄[3]等。目前，應(yīng)用于植物DNA分子標(biāo)記技術(shù)主要有RFLP、RAPD、SSR、ISSR、AFLP、SNP等。本文主要對SSRs的發(fā)現(xiàn)過程、結(jié)構(gòu)特征、原理和類型、技術(shù)優(yōu)缺點、產(chǎn)生多態(tài)性的機理等方面，以及在植物遺傳育種中的應(yīng)用進行概述。

1.1 SSR簡介

SSR（Simple sequence repeats，簡單重復(fù)序列）又稱微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）標(biāo)記。SSR序列是指由1～6個堿基組成的基序（motif）串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長度大多在100～200bp。SSR廣泛分布于真核生物基因組中的非編碼區(qū)、3′、5′非翻譯區(qū)及內(nèi)含子中，也有少量分布于外顯子、啟動子或基因組的其它位置中。

1.2 SSR分布

1.2.1 SSR序列在植物中廣泛存在

隨著結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的發(fā)展，大規(guī)?；蚪M和EST序列的測定，為研究SSR序列在基因組中的分布提供了豐富資源。近年來相關(guān)研究表明，SSR分布于植物整個基因組，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)，平均23.3kb就有一個SSR；隨著SSR分子標(biāo)記的發(fā)展，在大豆、玉米、小麥、高粱、番茄、水稻、馬鈴薯、葡萄、桑樹、蔬菜、棉花、花生、人參、擬南芥、黑松、云杉、楊樹等基因組DNA序列中都已發(fā)現(xiàn)大量的SSR位點。

1.2.2 SSR序列在基因組中的分布差異

SSR序列在不同基因組中的分布具有很大差異。例如：雖然水稻和擬南芥基因組都包含大量SSR位點，但兩者之間存在明顯的分布差異[4]。SSR序列在以水稻為代表的單子葉植物基因組傾向出現(xiàn)高G+C含量的重復(fù)類型，這種分布差異可能與基因組的組成結(jié)構(gòu)有關(guān)，因其基因組富含堿基G和C，而以擬南芥為代表的雙子葉植物基因組則較多出現(xiàn)富含A+T的SSR序列。SSR序列在不同物種基因組中的分布具較大差異可能是一個普遍現(xiàn)象，即使在相近基因組之間，SSR序列的分布也存在明顯差異[5]。

1.2.3 SSR序列在植物基因組中的分布特征

研究發(fā)現(xiàn)SSR序列在植物基因組中的分布傾向出現(xiàn)在基因組的單拷貝或低拷貝區(qū)域，并非都集中于基因組的重復(fù)區(qū)域。植物SSR序列的發(fā)生頻率與基因組單拷貝DNA的含量呈顯著正相關(guān)，即隨著基因組重復(fù)序列的擴張，SSR序列在植物基因組中的出現(xiàn)間隔隨之增大[6]。SSR序列大量出現(xiàn)于植物基因組的基因富集區(qū)域，尤其集中于基因上游調(diào)控區(qū)，其發(fā)生頻率遠遠高于基因組的其它區(qū)域[7]。

1.3 SSR功能

在植物基因組中，長期以來人們一直認為SSR在基因組中沒有明確的生物學(xué)功能，通常只是作為一種中性進化的DNA分子標(biāo)記用于相關(guān)應(yīng)用研究。隨著基因組以及表達序列的大量測定，發(fā)現(xiàn)SSR序列在植物基因組中的存在比之前認識的復(fù)雜很多[8]。

1.3.1 編碼區(qū)SSR功能

位于基因編碼區(qū)的SSR序列，其重復(fù)單元的擴增或縮減直接影響相應(yīng)編碼產(chǎn)物，從而導(dǎo)致蛋白功能的改變，甚至直接造成個體表型差異。對于編碼區(qū)SSR序列的功能研究，目前還局限于與人類疾病相關(guān)位點的研究，植物基因編碼區(qū)SSR序列的不穩(wěn)定性引起的基因功能改變迄今還鮮見報道。但在植物基因編碼區(qū)同樣存在著大量的SSR重復(fù)序列，而這些位于編碼區(qū)的SSR序列，其長度的易變性同樣會影響到一些基因的正常功能，甚至造成植物一些表型的改變。

1.3.2 調(diào)控區(qū)SSR功能

SSR序列不僅存在于基因編碼區(qū)，而且大量分布于基因調(diào)控區(qū)，在基因表達調(diào)控中起著重要作用。位于基因調(diào)控區(qū)的SSR序列的不穩(wěn)定性影響基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而導(dǎo)致植物生理生化、甚至是表型的改變。目前，普遍認為SSR序列存在兩種不同的表達調(diào)控機制：一種是SSR本身就是蛋白質(zhì)結(jié)合位點，通過與轉(zhuǎn)錄因子等特定蛋白結(jié)合直接對相關(guān)基因起調(diào)控作用；另一種調(diào)控機制則是SSR序列的存在可以改變局部染色質(zhì)從而影響附近基因的轉(zhuǎn)錄活性。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點

位于基因調(diào)控區(qū)的一些SSR序列本身就是順式作用元件，其能被相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控蛋白識別結(jié)合實現(xiàn)特定基因的表達調(diào)控[9]。作為順式作用元件的SSR序列，其長度的不穩(wěn)定性可能影響到與轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控蛋白的結(jié)合能力，從而對基因的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生影響[10]。研究顯示GA二核苷酸重復(fù)元件在植物基因調(diào)控區(qū)也廣泛出現(xiàn)，其能被一些綁定蛋白所識別參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[11-13]。作為順式作用元件，SSR序列的長度不穩(wěn)定性可能影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的結(jié)合，從而引起相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的改變。

1.3.4 影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)

許多數(shù)據(jù)顯示SSR重復(fù)序列可能有助于DNA形成無核小體區(qū)域，從而改變局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。SSR序列在DNA復(fù)制過程中極不穩(wěn)定，經(jīng)常發(fā)生長度變異，而這些長度突變可能影響SSR重復(fù)元件與調(diào)控蛋白的結(jié)合，或者改變核小體位置分布，從而影響基因表達改變。

1.3.5 翻譯調(diào)控功能

調(diào)控區(qū)SSR位點不僅對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控有著重要作用，而且對基因翻譯同樣也發(fā)揮作用，位于非翻譯區(qū)（untranslated regions， UTR）的SSR位點長度改變可以影響下游基因的翻譯效率。Hulzink等研究發(fā)現(xiàn)煙草花粉管發(fā)育相關(guān)基因ntp303上游非翻譯區(qū)（5’UTR）的GAA重復(fù)元件是該基因表達調(diào)控和翻譯的關(guān)鍵元件，該SSR位點的缺失不僅會導(dǎo)致ntp303基因的mRNA轉(zhuǎn)錄量比正常水平降低2倍，更顯著的是蛋白質(zhì)翻譯量只及原有水平的6%[14]。

2 SSR產(chǎn)生機制及多態(tài)性形成機理

2.1 SSR產(chǎn)生機制

SSR序列在遺傳過程中極不穩(wěn)定，具有豐富的多態(tài)性，其高度多態(tài)性主要表現(xiàn)為基本單位串聯(lián)數(shù)目的高度變異。SSR核心序列的堿基構(gòu)成和重復(fù)次數(shù)在不同的物種或同一物種的不同基因型間是隨機的，導(dǎo)致了SSR長度的高度變異性[15]。這些變異性正是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。

SSR序列的突變速率遠高于基因組非重復(fù)區(qū)域，其突變速率在不同物種、不同位點間存在較大差異，一般每個位點每一世代發(fā)生的突變率介于10-6至10-2之間[16-18]。影響SSR序列不穩(wěn)定性的因素很多，主要包括SSR位點長度以及組成SSR序列的重復(fù)單元長度兩個因素[19，20]。研究表明SSR位點長度是影響其突變率的最主要因素，SSR序列突變速率隨重復(fù)單元數(shù)目的增加而加快[17，21]。

2.2 SSR多態(tài)性形成機理

SSR序列的不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)為核心序列在重復(fù)數(shù)目上的變異。雖然SSR序列不穩(wěn)定性的分子機制目前尚未完全清楚，但關(guān)于SSR序列長度變異的分子機制主要存在滑動假說、重組假說、不均等交換假說等幾種假說[22]。基本上大多數(shù)科研工作者都比較支持滑動假說。

2.2.1 復(fù)制滑移突變

DNA聚合酶滑移（replication slippage）是目前廣泛接受的SSR序列長度變異機制，該假說由Levinson和Gutman于1987年首先提出[23]，被認為是產(chǎn)生SSR變異的主要因素[19]。該突變假說認為在DNA復(fù)制過程中，聚合酶從DNA結(jié)合位置上脫離，造成模板鏈和新生鏈的暫時分離；經(jīng)過短暫脫離后，聚合酶重新與DNA結(jié)合，使模板鏈和新生鏈部分復(fù)性。如這一脫離/結(jié)合過程發(fā)生在SSR重復(fù)區(qū)域的復(fù)制過程，則新生鏈上的重復(fù)單元可能與模板鏈上的重復(fù)單元發(fā)生滑移錯配，導(dǎo)致模板鏈或新生鏈產(chǎn)生一個或多個單鏈環(huán)。如果單鏈環(huán)產(chǎn)生在新生鏈上，則導(dǎo)致新生鏈上的SSR位點發(fā)生插入突變，相對于模板鏈，其對應(yīng)SSR序列長度增加（圖1a）。反之，如果單鏈環(huán)產(chǎn)生在模板鏈上，將致使新生鏈的SSR位點發(fā)生缺失突變，相對于模板鏈上的SSR位點，新生位點重復(fù)單元減少（圖1）。DNA聚合酶滑移假說得到了體外實驗的證實，在PCR擴增過程中聚合酶滑移錯配同樣可以導(dǎo)致SSR位點的長度突變[24，25]。在生物體內(nèi)，雖然大部分滑移錯配產(chǎn)生的單鏈環(huán)能被錯配修復(fù)系統(tǒng)識別并得到糾正，但仍有一小部分錯配逃過修復(fù)系統(tǒng)而未被修復(fù)，從而導(dǎo)致SSR重復(fù)區(qū)域在復(fù)制過程產(chǎn)生的長度突變被保留下來[26]。

2.2.2 重組突變

染色體重組是另一可能導(dǎo)致SSR長度突變的分子機制[27]。該觀點最初認為染色體不對等交換（unequal crossover）在SSR重組突變中占主導(dǎo)地位。通過SSR重復(fù)區(qū)的不等交換，使不同染色單體上的等位位點發(fā)生相反的突變。

2.3 SSR的特點

2.3.1 SSR優(yōu)點

由于SSR標(biāo)記具有RFLP的所有遺傳學(xué)優(yōu)點，比RFLP分析容易得多，易于分析自動化，且避免了RFLP方法中使用放射性同位素的缺點；又比RAPD重復(fù)性和穩(wěn)定性高；比AFLP方法操作簡單且成本低；比SNP方法更適合大樣本多位點檢測，因此目前SSR標(biāo)記已成為很多領(lǐng)域研究的熱門技術(shù)。

SSRs是一種較理想的分子標(biāo)記，與其他分子標(biāo)記相比，它的特殊性及重要性在于其有以下特征：（1）SSR序列數(shù)量豐富，可以提供幾乎整個基因組的遺傳信息[28]；（2）SSR遺傳信息量大，一個SSR位點最多可以檢測到26個等位基因[29]。而且所顯示的帶型較簡單，記錄的條帶一致、客觀、明確。（3）信息含量高，其多態(tài)性較RFLP及RAPD高，對于多態(tài)性低的物種，是一個非常有價值的分子標(biāo)記系統(tǒng)。在植物當(dāng)中，微衛(wèi)星已被證明在很多物種中是高信息量的，并且是位點特異的分子標(biāo)記[30]；（4）以孟德爾方式遺傳，呈共顯性，不易被自然選擇和人工選擇所淘汰，能夠鑒別出純合基因型與雜合基因型，提供完整的遺傳信息。因而對個體鑒定具特殊意義，這為遺傳學(xué)研究提供了更多可供分析的信息[31]；（5）易于通過PCR技術(shù)迅速測定分析；（6）所需DNA量少，且對其質(zhì)量要求不高，即使是長期保存或有部分降解的樣品均可進行分析不需使用同位素，對人體無害；（7）實驗程序簡單，耗時短，實驗成本較低；（8）實驗重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠；便于進行數(shù)據(jù)比較；（9）SSR位點兩側(cè)的序列具有高度的保守性，在同種而不同遺傳型品種間多相同，在種屬間有良好的通用性便于重復(fù)利用已知引物。

因此，SSR標(biāo)記已作為重要的遺傳標(biāo)記，被廣泛用于植物遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、構(gòu)建指紋圖譜、遺傳多樣性分析及物種進化與親緣關(guān)系的研究、品種純度檢測、QTL分析及分子輔助育種、群體遺傳學(xué)研究、開展交配系統(tǒng)分析、比較基因組學(xué)、品種指紋圖譜繪制、目標(biāo)性狀分子標(biāo)記篩選等領(lǐng)域中[32，33]。

2.3.2 SSR缺點

SSR標(biāo)記技術(shù)也具有不足之處，主要的缺點是在某一物種的DNA序列未測序的情況下，要獲得微衛(wèi)星，需要知道重復(fù)序列兩端的序列信息，引物設(shè)計要根據(jù)微衛(wèi)星兩端的序列而定，因此不易獲得。目前已有很多植物發(fā)表了SSR位點引物序列，可直接利用[34]。隨著更多SSR多態(tài)性位點的開發(fā)及SSR標(biāo)記技術(shù)的進步，這一有價值的分子遺傳標(biāo)記技術(shù)必將引入更多的植物分子標(biāo)記中。

3 SSR標(biāo)記在植物遺傳育種中的主要應(yīng)用

3.1 構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜

遺傳圖譜（genetic map）又稱連鎖圖譜（1inkage map），遺傳連鎖圖表示的是各標(biāo)記所對應(yīng)物種的基因在其染色體上的相對位置，是進行基因定位、克隆、種質(zhì)進化、性狀遺傳和植物輔助選擇育種等應(yīng)用的基礎(chǔ)，為功能基因組學(xué)、遺傳學(xué)以及遺傳育種等領(lǐng)域的研究提供技術(shù)平臺和理論依據(jù)。傳統(tǒng)的遺傳圖譜中所用到的生理、生化標(biāo)記在用來組成兩親本材料上時，數(shù)量極為有限，而且圖譜分辨率的飽和度也很低，圖距大，因此其發(fā)展緩慢。分子標(biāo)記的快速發(fā)展，實現(xiàn)了將DNA分子水平上的變異作為遺傳標(biāo)記來構(gòu)建遺傳圖譜的構(gòu)想。其中SSR分子標(biāo)記以其具有共顯性、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好等獨特的優(yōu)點，成為構(gòu)建高密度連鎖圖的有效工具[35]。

近年來，SSR分子標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于小麥，玉米，水稻，大豆，蘋果，番茄，辣椒等植物的遺傳圖譜的構(gòu)建當(dāng)中。張帆等[36]通過159對多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的SSR引物構(gòu)建了長度為1 775.75cm的玉米遺傳連鎖圖譜。2002年Susan等[37]把均勻分布在水稻全部染色體上120個SSR整合到已構(gòu)建好的RFLP遺傳圖譜上，完成了2 240個SSR構(gòu)建的遺傳圖譜。Akkage等[38]構(gòu)建了含有34個SSR標(biāo)記的大豆遺傳連鎖圖譜。2005年趙姝華等[39]利用104對SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了包含10個連鎖群體，長度為1 656cm的高粱連鎖圖譜。Moretzsohn等[40]從433對SSR引物中篩選出204個擴增條帶穩(wěn)定、多態(tài)性高的引物對以野生品種A.duranensis和A.stenosperma為親本構(gòu)建的F2群體進行研究，構(gòu)建了總長1 230.89cm的花生遺傳連鎖圖，平均每個標(biāo)記之間的距離為7.24cm。Nguyen等[41]構(gòu)建了具有1 160個標(biāo)記位點圖譜長度為5 519cm的陸地棉分子遺傳圖譜。李媛媛等[42]利用143個SSR標(biāo)記構(gòu)建了甘藍型油菜的遺傳圖譜。Sorensen等[43]借助SSR和AFLP分子標(biāo)記構(gòu)建了馬鈴薯的遺傳連鎖圖譜。 3.2 功能基因定位、克隆和QTL分析

3.2.1 基因定位和QTL分析

高密度SSR遺傳連鎖圖譜的成功構(gòu)建為目的基因或QTL定位奠定了基礎(chǔ)?；蚨ㄎ痪褪蔷_定位與目的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記并確定其在染色體上的位置。植物的這些重要性狀的基因包括植物的抗蟲性、抗病性和雄性不育性等質(zhì)量性狀的基因，，還包括植株高度、生育期、開花期和產(chǎn)量等數(shù)量性狀基因座。

QTL定位是在生物的遺傳圖譜上對控制數(shù)量性狀的不連續(xù)的孟德爾因子進行定位，確定QTL與遺傳標(biāo)記間的距離并計算其效應(yīng)。由于SSR呈共顯性、在基因組中隨機分布，因此通過分析SSR位點與功能基因或QTL之間的連鎖關(guān)系，就可以將與育種有關(guān)的有價值的主效基因或QTL定位在染色體上或連鎖群中。

迄今為止利用SSR標(biāo)記已將玉米、水稻和小麥、辣椒、棉花和馬鈴薯等植物的許多重要性狀的基因定位在連鎖圖上。Blair等[44]在水稻中發(fā)現(xiàn)有3個微衛(wèi)星與白葉枯病抗性基因Xa-5相連鎖。Song等[45]通過439對SSR引物繪制了含有151個SSR位點的高油玉米的遺傳連鎖圖，并將27個控制玉米籽粒油分含量的QTL進行了定位。王鳳格等[46]利用65個SSR標(biāo)記構(gòu)建了玉米的遺傳連鎖譜，同時將玉米抗甘蔗花葉病毒的數(shù)量性狀位點定位在了遺傳圖譜上，并進行了遺傳效應(yīng)分析。王沛政等[47]對易感枯萎病的軍棉1號和高抗的中棉所35雜交后的F2代進行SSRs分析，結(jié)果檢測出D3染色體上的JESPR304-280與抗枯萎病基因緊密連鎖。Wang等[48]利用SSR標(biāo)記對棉花海7124和新陸早1號及其雜交后的F2∶3代進行分析構(gòu)建了含有41個連鎖群的遺傳連鎖圖譜并將6個數(shù)量性狀基因座位定位到D亞基因組上。Sebolt等[49]以野生大豆群體作為材料，分別將2個脂肪QTL和2個蛋白主效QTL定位于I連鎖群上。Hoecka等[50]將與大豆粒重有關(guān)QTL定位在L連鎖群上。Demirbs等[51]在耐大豆疫霉根腐病基因的研究中，利用SSR標(biāo)記分別將已知基因Rps1，Rps2，Rps3，Rps4定位于N，J，F(xiàn)，G連鎖群上，并將Rps6基因定位于G連鎖群上；Chen等[52]在12個連鎖群上定位了馬鈴薯中編碼控制淀粉代謝酶的17個QTLs。Bradshaw等[53]通過SSR標(biāo)記對四倍體馬鈴薯親本及其全同胞子代的抗瘡痂病和干物質(zhì)含量重要的農(nóng)藝性狀和加工品質(zhì)性狀進行了定位分析，共定位了39個QTL，其中在第五條染色體上定位了1個熟性QTL和1個干物質(zhì)含量QTL。由此可見，隨著以SSR為主遺傳圖譜的成功構(gòu)建， SSR標(biāo)記技術(shù)在植物基因定位和QTL分析中的應(yīng)用將會更加廣泛。

3.2.2 圖位克隆

圖位克?。╩ap-based cloning）又稱定位克隆（positional cloning），該項技術(shù)于1986年首先由劍橋大學(xué)的Coulson等[54]提出。雖然到目前為止圖位克隆技術(shù)僅在理論上適用于一切基因，被認為是最為通用的基因識別途徑。但我們相信隨著大尺寸物理圖譜的繪制、高密度遺傳圖譜的構(gòu)建和大片段基因組文庫和基因組全序列的提供，圖位克隆將會更廣泛的應(yīng)用到實際操作中去。圖位克隆技術(shù)先后應(yīng)用于番茄[55]、大麥[56]、小麥[57]、甜菜[58]等植物中。李家洋等[59]克隆了水稻中一種其表達的蛋白能夠促進腋芽分生的MOC1基因。張啟發(fā)等[60]成功克隆了水稻中調(diào)控其開花時間、影響其生長周期的基因。Liu等[61]利用定位于甘藍型油菜SSR遺傳連鎖圖譜的A6染色體上的EST-SSR標(biāo)記，將引起甘藍型油菜矮化的基因sd-1克隆出來了。Zheng等[62]將控制玉米胚含油量和種子含油量的基因DGAG1-2定位在兩個SSR標(biāo)記之間，并通過圖位克隆獲得了功能基因。

3.3 品種鑒定與指紋圖譜建立

SSR標(biāo)記技術(shù)對品種的鑒定和分類實質(zhì)上是直接從DNA分子水平上進行的，其準確率高。而SSR指紋圖譜就是品種鑒定的獨特特征。目前主要有兩種指紋圖譜，一種是較早研究的同工酶和蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜， 但是其多態(tài)性水平很低，對不同品種很難進行有效的區(qū)分。另一種是DNA指紋圖譜?，F(xiàn)在用于構(gòu)建DNA指紋圖譜的分子標(biāo)記主要有RFLP、SSR、AFLP和RAPD等，其中RFLP技術(shù)復(fù)雜，要求高，且多態(tài)性低于SSR。RAPD可靠性低，難以得到廣泛應(yīng)用。因此SSR技術(shù)更適合用于品種鑒定和構(gòu)建指紋圖譜的分析研究。吳渝生等[63]以3個云南省的玉米雜交種及其親本為材料，篩選出24對多態(tài)性高的引物， 建立了SSR標(biāo)記指紋圖譜.譚君等[64]通過6對SSR引物將73份供試玉米自交系區(qū)分開，并建立了西南地區(qū)常用玉米自交系的指紋圖譜.王風(fēng)格等[65]用SSR技術(shù)構(gòu)建的中國玉米品種DNA指紋庫。從夕漢等[66]以中國56個雜交水稻骨干親本為研究材料，用14對核心引物構(gòu)建了SSR指紋圖譜。許鯤等[67]采用18對多態(tài)性好、帶紋清晰的SSR引物構(gòu)建102份冬油菜新品種DNA指紋圖譜。Charters等[68]通過5’端錨定SSR引物（anchored SSR primer）構(gòu)建了20個甘藍油菜品種指紋庫。Feingold等[69]利用位于已構(gòu)建好的遺傳圖譜上的61對SSR引物，獲得了30個來自歐洲、南美洲、北美洲以及它們雜交種的馬鈴薯指紋圖。段秦利等[70]利用2對篩選好的多態(tài)性高的SSR引物，對新疆陸地棉進行了指紋圖譜構(gòu)建和雜交種純度鑒定。

3.4 SSR標(biāo)記輔助選擇育種

在植物育種中，人們在選取材料時，通常是直接選擇植株的目標(biāo)性狀或是通過形態(tài)學(xué)標(biāo)記來間接選擇目標(biāo)性狀，對于易受環(huán)境影響的數(shù)量性狀而言其精準性很差。而SSR輔助選擇育種具有以下優(yōu)勢：（1）可以間接地進行早代選擇或苗期鑒定，因為標(biāo)記輔助育種可在低世代和植株生長發(fā)育的不同階段、不同組織進行選擇，大大加快了育種速度[71]；（2）共顯性的分子標(biāo)記使得在分離世代中能夠準確快速地鑒定出植株的基因型，即使在雜合體階段也能鑒定出隱性基因[72]；（3）對目標(biāo)性狀的選擇不受基因效應(yīng)和各種環(huán)境因素的影響，結(jié)果可靠[73]；（4）MAS尤其是對由多基因位點控制的很多重要農(nóng)藝性狀、低遺傳力性狀、限制性狀和后期表達的性狀可以加速植物品種遺傳改良的進程[74]?，F(xiàn)SSR標(biāo)記已在植物回交育種、雜種優(yōu)勢和植物抗性育種等領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用，這對于創(chuàng)新一個高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的新品種具有重大意義[75，76]。

迄今為止，SSR標(biāo)記的輔助選擇育種在水稻、小麥、大豆、棉花等植物上已取得了很多顯著性的成果。Zhang等[77]利用SSR標(biāo)記對水稻耐熱性與開花期QTLs的遺傳效應(yīng)關(guān)系進行研究時，發(fā)現(xiàn)SSR四號染色體上的RM3735位點可用于水稻耐熱性標(biāo)記輔助育種的研究。Karakousis等[78]通過對與大麥中控制16個重要性狀的18個位點緊密連鎖的SSR標(biāo)記進行研究，發(fā)現(xiàn)在標(biāo)記輔助育種（MAS）中信息含量豐富的SSR標(biāo)記是非常重要的。石玉真

等[79]利用一個與已在棉花遺傳圖譜上定位的高強纖維QTL緊密連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記成功培育出9個棉花纖維強度很高的優(yōu)質(zhì)株系。Abdurakhmonov等[80]利用SSR標(biāo)記對野生棉花種質(zhì)資源的纖維質(zhì)量性狀方面進行分析，結(jié)果表明基于關(guān)系標(biāo)本圖的連鎖不平衡在標(biāo)記輔助育種的應(yīng)用上十分重要。Moloney等[81]在馬鈴薯第五連鎖群上定位了一個主要控制抗馬鈴薯白線蟲變種Pa2/3的數(shù)量位點GpaIVsadg，在含抗馬鈴薯白線蟲變種Pa2/3的C1992/31育種材料和易感品種Record雜交的F1群體中確定該目標(biāo)位點，再利用與該位點緊密連鎖SSR標(biāo)記和SNP篩選回交子代的178個基因型，研究表明，分子標(biāo)記輔助對選擇持久、高抗馬鈴薯白線蟲變種Pa2/3的品種是非常有效的。

3.5 親緣關(guān)系和遺傳多樣性的研究

生物的遺傳多樣性是通過對生物由基因型控制的性狀的影響，并維持生物的繁殖活力、抗病蟲害的能力及環(huán)境變化的適應(yīng)能力等，從而對生物的分布情況和系統(tǒng)發(fā)育機制產(chǎn)生影響。因此，對生物種質(zhì)資源的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系的研究，將有利于更多的了解生物多樣性的進化機制，估測基因資源的分布，預(yù)測生物種源的適應(yīng)性，進而推動生物育種學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展，并為生物種質(zhì)資源的合理利用，收集、保護，親本選配，新品種的培育等提供理論依據(jù)[82]。

傳統(tǒng)方法對種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性的分析主要是根據(jù)植物的表型性狀，但因為表型性狀易受環(huán)境因素的影響，而且親緣關(guān)系較近的種質(zhì)資源表現(xiàn)型基本上非常相像，很難進行鑒別。而分子標(biāo)記則反映的是種質(zhì)資源在基因型水平上的核苷酸序列差異，即從本質(zhì)上揭示生物的遺傳變異規(guī)律。其中SSR標(biāo)記更能夠精確真實的呈現(xiàn)出基因型中不同的品種或是不同親緣關(guān)系的物種之間的差異，原因是當(dāng)用同一個SSR引物對不同材料進行PCR擴增時，由于模板DNA數(shù)目不同或在基因組中位點的不同，相對應(yīng)的擴增片段的大小和條帶的數(shù)量也是不同的，因此會呈現(xiàn)出多態(tài)性。當(dāng)用一定數(shù)量的SSR引物大規(guī)模的對研究對象進行分析時，就會表現(xiàn)出更豐富的多態(tài)性，經(jīng)統(tǒng)計分析后即可進行遺傳多樣的評估[83]。因此該技術(shù)在植物亞種內(nèi)或生態(tài)型內(nèi)的種質(zhì)鑒定及遺傳多樣性分析上具有明顯優(yōu)勢。

近幾年來，隨著分子標(biāo)記的改進和發(fā)展，SSR標(biāo)記技術(shù)已被廣泛用于玉米、大豆、小麥、水稻、馬鈴薯等植物種內(nèi)或種間的種質(zhì)鑒定及遺傳多樣性分析等研究中。

Barcaccia等[84]利用84對SSR標(biāo)記對意大利1個玉米地方品種10個居群的種質(zhì)資源進行了親緣關(guān)系及遺傳多樣性的分析。Desplanque等[85]以從法國多地收集的54個種群的300個甜菜品種為供試材料，利用SSR標(biāo)記技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)野生甜菜要比栽培甜菜的遺傳多態(tài)性豐富。王紹鵬等[86]以黑龍江省7個馬鈴薯主栽品種為實驗材料，利用四對SSR引物對其進行進行遺傳多樣性分析，共檢測出144個多態(tài)性位點。Wang等[87]大規(guī)模的收集了西藏、云南、新疆的小麥資源，利用206對SSR引物對這些材料進行遺傳多樣性的檢測，聚類結(jié)果顯示：西藏與云南小麥品種的親緣關(guān)系要比新疆與云南及新疆與西藏的近很多。Stella等[88]通過用來源于基因組和ESTS序列的共1 500多對SSR引物對亞洲棉核心種質(zhì)進行分析，篩選出了25對信息含量大且能夠鑒別出亞洲陸地棉遺傳多樣性的SSR標(biāo)記。Pell等[89]通過對113份二倍體粗山羊草進行SSR分析，發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記應(yīng)用于遺傳多樣性的分析是非常具有優(yōu)勢的，而且在理論上對種質(zhì)資源的收集和保護都非常有價值。趙衛(wèi)國[90]等利用15對SSR引物和24個ISSR引物對8個野生桑樹種和19個桑樹栽培品種進行了遺傳多樣的分析。

綜上所述，SSR標(biāo)記技術(shù)不僅在植物親緣關(guān)系鑒定、遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、基因定位、QTL定位、標(biāo)記輔助育種方面有著巨大的應(yīng)用價值和優(yōu)勢，而且在系譜分析、雜種優(yōu)勢預(yù)測、種質(zhì)資源的評估與保護、種子純度與品種真實性鑒定、抗病基因的檢測等領(lǐng)域表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

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