摘 要：本文綜述了五種重要的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法（農(nóng)桿菌介導法，聚乙二醇法，基因槍法，花粉通道法和電激穿孔法）及其應用，并闡述了植物轉(zhuǎn)基因技術在抗除草劑，抗逆性和品質(zhì)改良等方面的研究進展。

關鍵詞：轉(zhuǎn)基因技術；應用；研究進展

Abstract：In this paper，a brief introduction about the principle and application of the five DNA transformation techniques：Agrobacterium-mediated transformation，Polyethylene glycol method，gene gun bombardment，electroporation method and pollen-tube pathway transformation and has been review.Illustrates the progress in the application of plant genetic improvement，including herbicide resistant，stress resistance，quality improvemrnt.

Key words：transgenic technology；application；research review

20世紀70年代末，關于轉(zhuǎn)基因植物的研究開始出現(xiàn)，當時研究人員利用野生型Ri和Ti質(zhì)粒對細胞進行轉(zhuǎn)化，只在一小部分植物（如煙草、馬鈴薯）上成功再生出轉(zhuǎn)基因植株[1，2]。三十年來，隨著科學家對高等植物組織培養(yǎng)技術和基因重組技術的深入研究以及這些技術的快速發(fā)展，植物轉(zhuǎn)基因技術應運而生。轉(zhuǎn)基因技術，也被稱為基因工程，植物基因工程是現(xiàn)代植物生物技術的研究核心。它是按照人們的意愿將外源DNA（基因）重組到受體細胞基因組中并使之得到特異性表達。利用植物基因工程能夠克服植物遠緣雜交的不親和障礙，擴大物種雜交的范圍，加快變異速度，提供了定向創(chuàng)造生物的可能性。因此，轉(zhuǎn)基因技術是改良品種，開發(fā)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效兼抗性作物新類型和新品種的重要途徑。

1983年，比利時科學家Montague和美國Fraley等人將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT）基因通過農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入煙草細胞，得到了抗卡那霉素的煙草愈傷組織，并成功獲得世界上首株抗病毒轉(zhuǎn)基因煙草，這標志著人類希望通過轉(zhuǎn)基因技術對植物品質(zhì)進行改造，將抗除草劑基因、抗病基因、抗蟲基因、抗環(huán)境脅迫性狀基因和特殊蛋白基因等有益基因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物中，使之獲得所需的優(yōu)良遺傳性狀成為可能。迄今為止已經(jīng)成功培育出轉(zhuǎn)基因煙草，水稻，番茄，棉花，大豆，玉米和矮牽牛等轉(zhuǎn)基因植物近200種，植物轉(zhuǎn)基因技術在作物改良和作物育種等研究方面有著至關重要的作用。本文介紹了幾種常用且有效的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，以及植物轉(zhuǎn)基因技術的應用和展望。

1 植物轉(zhuǎn)基因技術的方法

植物轉(zhuǎn)基因技術根據(jù)轉(zhuǎn)化過程中是否需要載體，可劃分為兩大類：直接導入技術和間接導入技術。直接導入技術即是不依賴其他載體，直接將經(jīng)過一些特殊處理的裸露DNA導入到植物細胞或原生質(zhì)體中來實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的。直接導入技術主要采用的方法是化學方法（聚乙二醇介導法）和物理方法（如基因槍法、花粉管通道法、電激穿孔法、顯微注射法以及超聲波導入法等）。間接導入技術主要是將外源基因插入到農(nóng)桿菌的質(zhì)粒上或是病毒載體的DNA上，再通過載體將外源基因重組到植物細胞基因組中，其方法主要有農(nóng)桿菌介導法和植物病毒介導法。目前，農(nóng)桿菌介導法，基因槍法，聚乙二醇（PEG）介導法，電激穿孔法和花粉管通道法是在植物遺傳轉(zhuǎn)化中廣泛應用的幾種方法。

1.1 農(nóng)桿菌介導法

農(nóng)桿菌介導法是先將插入目的基因的植物表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，然后通過農(nóng)桿菌侵染植物，將根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)?；虬l(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒上的目的基因?qū)胫参锸荏w細胞并整合到其基因組中，從而完成目的基因的轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導法是目前為止應用最早，研究最深入，應用最廣泛，技術相對成熟、有效的轉(zhuǎn)基因方法。自1983年首次運用農(nóng)桿菌介導法獲得轉(zhuǎn)基因植物以來，研究人員相繼利用該方法獲得了番茄，牽?；ê陀筒说绒D(zhuǎn)基因植株，迄今全球有超過80%的轉(zhuǎn)基因植物是利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化成功的。1985年Horsh等創(chuàng)立了葉盤轉(zhuǎn)化法，它是利用根癌農(nóng)桿菌侵染植物外植體（植物組織、幼苗）后與之共培養(yǎng)來實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，該方法簡單有效，廣泛應用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化[3，4]。長期以來農(nóng)桿菌介導法僅限于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，直至近年研究表明，酚類物質(zhì)（如乙酰丁香酮）可促進農(nóng)桿菌吸附在植物細胞和幼苗上，以此提高轉(zhuǎn)化率。因而通過在轉(zhuǎn)化過程中加入信號傳導物質(zhì)成為農(nóng)桿菌介導法在用于單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化上的重要突破[5，6]，一些主要單子葉植物如水稻[7]、玉米[8]和大麥[9]均通過農(nóng)桿菌介導法成功得到了轉(zhuǎn)基因植株。與其他方法相比，農(nóng)桿菌介導法有著明顯的優(yōu)勢[10]，該方法操作簡便，所需費用低，可用于轉(zhuǎn)化相對較大的DNA片段，能更有效地產(chǎn)生單位點整合，不易產(chǎn)生基因沉默，能夠穩(wěn)定遺傳，而且轉(zhuǎn)化率和重復性較好，并能得到可育的轉(zhuǎn)基因植株。但此方法的缺點是在轉(zhuǎn)化過程中很難掌握材料的抑菌程度且轉(zhuǎn)化過程會出現(xiàn)左邊界丟失現(xiàn)象等[11]。

1.2 基因槍法

1987年，美國康奈爾大學生物化學系的Sanford首次提出基因槍法[12]，也稱為粒子槍法、高速微彈法、微彈轟擊法。其原理是用鎢粉或金粉等金屬微粒包裹外源DNA，利用高壓放電或高壓氣體作為驅(qū)動力使金屬微粒高速運動擊入受體細胞或組織中，從而將外源目的基因整合到植物基因組中并培育出轉(zhuǎn)基因植株。同年Klein等首次利用基因法成功得到了轉(zhuǎn)基因玉米。目前，有很多植物通過基因槍技法轉(zhuǎn)化成功，如棉花[13]、水稻[14]、玉米[15]、小麥[16]、大豆[17]、土豆[18]等，它對于難再生植物的遺傳轉(zhuǎn)化更為實用?；驑尫椒ǖ膬?yōu)點是操作簡單、轉(zhuǎn)化時間短、對靶細胞及受體材料來源沒有嚴格要求、還能使外源基因轉(zhuǎn)化線粒體和葉綠體，使轉(zhuǎn)化細胞器成為可能[19]。其缺點是轉(zhuǎn)化植物整合位點不定、拷貝數(shù)多、嵌合體多、容易發(fā)生共抑制和基因沉默現(xiàn)象、所用儀器昂貴且轉(zhuǎn)化效率低。

1.3 聚乙二醇介導法

聚乙二醇（PEG）是植物遺傳轉(zhuǎn)化最常用的化學誘導劑。1980年Dayey等首次建立了聚乙二醇法。它的原理是在高pH條件下的PEG與原生質(zhì)體融合，原生質(zhì)體膜的通透性發(fā)生改變，加強了原生質(zhì)對外源DNA的吸收，使目的基因整合到原生質(zhì)體的基因組上并使之發(fā)生特異表達。1982年Krens[20]等進一步發(fā)展了這種通過PEG介導轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化體系。1988年Zhang等通過聚乙二醇法將GUS基因成功的轉(zhuǎn)入水稻的原生質(zhì)體中，并獲得了第一批轉(zhuǎn)基因水稻。此后，該方法也先后成功轉(zhuǎn)化了小麥，水稻，高梁，油菜和大豆等植物[20]。聚乙二醇法的優(yōu)點是對細胞的副作用小，轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定性、重復性好，并能實現(xiàn)一次轉(zhuǎn)化多個原生質(zhì)體，由于轉(zhuǎn)基因植株來自同一細胞，因而能有效避免嵌合轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)生。它的缺點是轉(zhuǎn)化率較低（一般為10-5～10-6），因為PEG對原生質(zhì)體有毒害作用，所以該方法不能用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，也不能用于再生困難的植物。

1.4 花粉管通道法

1983年科學家周光宇通過研究我國遠緣雜交提出了DNA片段雜交的假設[21]，為花粉通道法提供了理論基礎，并首次通過花粉管通道法將海島棉基因轉(zhuǎn)入陸地棉，并培育出抗枯萎病棉花新品種[22]。花粉管通道法是在植物授粉后的特殊時期，利用在植物開花過程中萌發(fā)的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵，進而使目的基因整合到受體植物基因組中，使其自然發(fā)育成種子并形成轉(zhuǎn)基因植株。利用花粉管通道法已成功轉(zhuǎn)化了棉花、水稻和小麥等農(nóng)作物[23]，培育出許多有抗逆性和優(yōu)良品質(zhì)的新品種。該方法的優(yōu)點是不需要組培再生過程，操作技術簡單，對外源基因、受體植物種類和儀器設備要求不高，育種周期短。缺點是在轉(zhuǎn)化過程中容易受植物本身和外界影響、轉(zhuǎn)化效率低、可重復性差。

1.5 電激穿孔法

電激穿孔法的原理是當植物細胞受到外界高壓電擊時，細胞膜會出現(xiàn)非對稱穿孔，但這種開放小孔的出現(xiàn)是具有可逆性，解除電擊后這些小孔會關閉，所以在此期間要利用這種小孔成為外源基因?qū)爰毎耐ǖ溃瑥亩鼓康幕驅(qū)氩⒄系绞荏w細胞的基因組上。1985年Michael等人首次利用電激穿孔法，在1400 V的高壓條件下處理細胞質(zhì)膜，使外源基因?qū)?，在培養(yǎng)2～4天后的原生質(zhì)體中檢測到外源基因的瞬時表達[25]。此后，電激穿孔法相繼成功的應用于煙草、番茄、玉米、水稻、大豆、小麥和馬鈴薯等植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。該方法優(yōu)點是對受體材料來源廣泛，操作簡便。缺點是轉(zhuǎn)化率低。

2 植物轉(zhuǎn)基因技術的應用

通過基因工程技術來改變植物基因特性，可以培育出人類需要的具有抗除草劑、抗蟲害、抗病或者抗寒、抗旱、抗鹽堿等具有優(yōu)良品質(zhì)的植物新品種和新品系。1986年首次批準轉(zhuǎn)基因作物進入田間試驗，之后近三十年里轉(zhuǎn)基因作物研究迅速發(fā)展，直至今天全球有30個國家被批準種植轉(zhuǎn)基因作物，種植總面積達到1.7億hm2，植物種植類達40余種。轉(zhuǎn)基因技術在全球迅速發(fā)展的同時，在我國也得到較快的發(fā)展。我國在棉花、水稻、玉米、大豆和小麥等作物轉(zhuǎn)基因的研究上獲得了可喜的成果。

2.1 抗除草劑

目前，抗除草劑植物的種植面積約占轉(zhuǎn)基因植物種植總面積的59%，是全球種植面積最大的一類轉(zhuǎn)基因植物[26]?？钩輨┑姆N類主要有草銨膦、草甘膦、2，4-D，咪唑啉酮和磺酰脲類。高濃度的2，4-D也是一種有效除草劑，1994年我國獲得的第一株轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花就是通過2，4-D單氧化酶基因?qū)朊藁ㄖ?，并獲得可遺傳植株。1994年，由抗溴苯腈作為選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因棉花開始用于種植。1996年到1998年，抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆，棉花，玉米以及抗草銨膦的油菜，棉花，玉米也陸續(xù)進入大面積種植。抗除草劑植物的廣泛種植，有效的節(jié)約了勞動力，大幅度提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率。

2.2 抗逆性

植物生長過程中會遇到很多的生物非生物脅迫，主要有蟲害，病害，干旱，鹽堿和極端溫度等。因此我們要通過轉(zhuǎn)基因技術來提高植物的抗逆水平。

最早應用的抗蟲基因是蘇云金桿菌毒蛋白基因（Bt）。1987年比利時科學家將Bt基因轉(zhuǎn)入煙草細胞，獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草。同年，我國利用農(nóng)桿菌介導法，首次將Bt基因轉(zhuǎn)入番茄和煙草中，并成功得到相應的可遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因植株。此后又成功的將Bt基因相繼轉(zhuǎn)入玉米、茄子和棉花等植物。Bt轉(zhuǎn)基因植物的細菌內(nèi)毒素只是對特定的害蟲（鱗翅目昆蟲）有較高的毒害作用，對人和非目標昆蟲幾乎沒有毒性[27]，但Bt基因的抗蟲譜較窄，昆蟲對其容易產(chǎn)生耐受性。目前除了Bt基因，常用的抗蟲基因還有蛋白酶抑制劑基因（PI）、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因、蝎毒素基因和蜘蛛素基因等。

目前抗病轉(zhuǎn)基因植物的種植面積遠遠低于抗除草劑和抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的種植面積[28]。它主要是通過向植物中轉(zhuǎn)入抗菌肽、幾丁質(zhì)酶和防御素來提高植物的抗病能力?；蚩共《巨D(zhuǎn)基因的分子機制主要有抑制病毒增殖，阻止病毒移動，RNA沉默介導三種機制。最常用、有效的方法就是利用RNA沉默介導實現(xiàn)植物的抗病能力的提高，利用該方法成功獲得了具有明顯抗病性的玉米[29]、大豆[30]、番茄[31]和大麥[32]等轉(zhuǎn)基因植物。

除了以上的抗性轉(zhuǎn)基因研究外，在抗寒、抗旱和耐鹽堿等抗環(huán)境脅迫方面的轉(zhuǎn)基因研究也有很大進展。目前，已有報道將抗凍蛋白、熱擊蛋白成功轉(zhuǎn)入玉米[33]、煙草[34]和番茄[35，36]中，獲得相應的抗寒轉(zhuǎn)基因植物，提高了它們的抗寒能力。通過向玉米中轉(zhuǎn)入6-磷酸海藻合成酶基因，來提高玉米的抗旱能力。也有研究表明，利用甜菜堿醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯[37]，花生、[38]、棉花[39]、胡蘿

卜[40]，轉(zhuǎn)基因植株仍能在NaCl脅迫條件下生長良好。

2.3 品質(zhì)改良方面

利用轉(zhuǎn)基因技術進行品質(zhì)改良主要目的是提高作物產(chǎn)品質(zhì)量和營養(yǎng)價值。目前應用于作物產(chǎn)品質(zhì)量改良的基因主要有：控制果實成熟的基因、谷物種子貯藏蛋白基因、控制脂肪合成基因等。我國研究人員已成功將高賴氨酸基因整合到玉米基因組上，獲得轉(zhuǎn)基因植株中賴氨酸含量提高了10%以上。獲得的延熟轉(zhuǎn)基因番茄的儲藏時間通常延長1～2個月，最高延熟時間甚至超過80天[41]。瑞士Potrykus等將類胡蘿卜素的相關合成基因成功轉(zhuǎn)入水稻，培育出有類胡蘿卜素的水稻，提高其營養(yǎng)價值。

3 植物轉(zhuǎn)基因技術的應用前景

植物轉(zhuǎn)基因技術是以分子生物學為研究手段，對目的基因進行人工分離、修飾和轉(zhuǎn)移，通過導入基因再表達，來賦予植物新的優(yōu)良性狀從而選育出新品種。利用植物轉(zhuǎn)基因技術來改造植物，可增強植物的抗逆性，有效防止病蟲害的發(fā)生，減少化學殺蟲劑和除草劑的使用，降低了生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染，降低對其他生物的傷害，同時可以減少占用耕地面積并改善了土地的生產(chǎn)能力。研發(fā)生物技術、開發(fā)轉(zhuǎn)基因作物，是提高農(nóng)產(chǎn)品供應和維護糧食安全可能的重要途徑之一。植物轉(zhuǎn)基因技術將帶來現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的一次革命，作為世界第一人口大國，中國不能拒絕生物技術和轉(zhuǎn)基因作物，加強對轉(zhuǎn)基因植物的研究和發(fā)展是我們的必然選擇。

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