【摘 要】采取三血管阻斷法（3-VO法），建立C57BL/6小鼠全腦缺血再灌注模型，從形態(tài)學(xué)組織切片上觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變化，用于進(jìn)一步研究腦缺血疾病的發(fā)生機(jī)制及臨床防治。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，3-VO法能引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化，減少正常神經(jīng)元的數(shù)量，且頸總動(dòng)脈結(jié)扎的時(shí)長(zhǎng)為決定動(dòng)物死亡率和神經(jīng)元損傷的重要因素，證實(shí)3-VO法能誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的病理學(xué)改變，為相關(guān)腦血管病的深入研究提供操作簡(jiǎn)便的動(dòng)物模型制作途徑。

【關(guān)鍵詞】全腦缺血再灌注 3-VO法 缺血性腦血管病

【中圖分類號(hào)】G642 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-4810（2014）21-0095-02

缺血性腦血管病是僅次于缺血性心臟病的導(dǎo)致人類死亡的第二大疾病。因此，全腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷闹谱髟谌毖阅X血管病的研究領(lǐng)域成為近年研究的熱點(diǎn)。該動(dòng)物模型的特點(diǎn)是可模擬腦血流中斷的狀態(tài)，引起主要集中于海馬CA1區(qū)、小腦的遲發(fā)性、選擇性神經(jīng)元損傷，尤其在海馬易損性等方面的應(yīng)用較為廣泛。桂林醫(yī)學(xué)院用C57BL/6小鼠三血管阻斷法（3 vessel occlusion，3-VO法），即結(jié)扎延髓腹側(cè)面的基底動(dòng)脈后短暫性阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈，從形態(tài)學(xué)組織切片上觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變化，為進(jìn)一步研究全腦缺血再灌注損傷提供依據(jù)和手段。

一 材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其分組與模型制作

取26～35g雄性C57BL/6小鼠40只，隨機(jī)分為假手術(shù)組以及Ⅰ～Ⅲ組。4%水合氯醛對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行麻醉，給藥容積為10ml/kg。實(shí)施麻醉后，將動(dòng)物仰臥位固定，頸正中切口，剪去枕骨腹側(cè)面部分顱骨，用5-0縫線（上海浦東區(qū)金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司生產(chǎn)）結(jié)扎延髓腹側(cè)面上的基底動(dòng)脈。分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線備用。依次縫合肌肉及皮膚，將動(dòng)物放置于38℃恒溫加熱板保持2小時(shí)，以維持正常體溫。24小時(shí)后，拆線打開(kāi)原手術(shù)傷口，同時(shí)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。Ⅰ～Ⅲ組分別于結(jié)扎后10、12、14分鐘后，小心取下結(jié)扎于雙側(cè)頸總動(dòng)脈的縫線，恢復(fù)灌注。假手術(shù)組動(dòng)物進(jìn)行以上除結(jié)扎基底動(dòng)脈以及雙側(cè)頸總動(dòng)脈之外的步驟。

2.腦組織標(biāo)本的取材、染色和觀察

手術(shù)7天后，將各動(dòng)物以4%水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉，暴露心臟，先用生理鹽水灌注30分鐘，待肝臟變白后，換成4%多聚甲醛灌流，直至動(dòng)物肝臟變硬，尾巴僵硬后，剪下頭部并開(kāi)顱取腦，再浸入4%多聚甲醛中1天。取出固定好的腦組織，經(jīng)沖洗、脫水、透明、包埋等步驟后，制成4μm厚連續(xù)切片，每隔10張切片取連續(xù)2張進(jìn)行尼氏染色，于高倍鏡下觀察拍照并對(duì)尼氏染色陽(yáng)性神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3.數(shù)據(jù)分析與處理

如無(wú)特殊說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組尼氏染色陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)用Wilcoxon Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)，并用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。

二 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.死亡率

基底動(dòng)脈結(jié)扎后的死亡率為85%。死亡原因考慮為：（1）麻醉后的自主呼吸喪失；（2）不可避免的技術(shù)性失敗，導(dǎo)致基底動(dòng)脈破裂或致死性出血。

雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后的動(dòng)物死亡無(wú)技術(shù)性死亡，均為缺血引起。第Ⅰ組無(wú)動(dòng)物死亡，然而隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，死亡率升高，如第Ⅱ組的死亡率上升到了27%，第Ⅲ組的死亡率達(dá)36%。死亡的時(shí)間多集中在全腦缺血后的3～5天（65%）。

2.腦組織切片觀察

假手術(shù)組細(xì)胞3～4層，排列整齊緊密，細(xì)胞核大而圓、核仁清晰；尼氏小體染色濃密規(guī)則（圖A）。Ⅰ～Ⅲ組細(xì)胞排列散亂、部分丟失、胞核固縮，尼氏小體染色呈現(xiàn)不同程度的變淡或消散，且胞漿出現(xiàn)嗜酸性變化（圖B～D）。

全腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色情況（放大倍數(shù)200×）。（A）假手術(shù)組動(dòng)物無(wú)CA1區(qū)海馬神經(jīng)元損傷。3-VO法全腦缺血10min（B）、12min（C）以及14min（D）后，可觀察到明顯的CA1區(qū)神經(jīng)元損傷。

每張尼氏染色切片高倍鏡下（200×）隨機(jī)選取大叔腦組織海馬雙側(cè)CA1區(qū)各5個(gè)不重疊的視野進(jìn)行尼氏染色陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)：假手術(shù)組128±6，Ⅰ組53±3，Ⅱ組45±6，Ⅲ組32±5，Ⅰ～Ⅲ組與假手術(shù)組相比，P<0.05，提示實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物神經(jīng)元變性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即3-VO法具有全腦缺血引發(fā)神經(jīng)元變性的能力。

三 討論

我們采取3-VO法制作小鼠全腦缺血模型，主要是通過(guò)基底動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈結(jié)扎，阻斷脊髓血流與腦血流之間的通路，從而引起短暫性的全腦缺血，引起海馬神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，病理性損傷的程度取決于頸總動(dòng)脈的結(jié)扎時(shí)長(zhǎng)，且結(jié)扎10分鐘是較為理想的缺血時(shí)間，因?yàn)槟芤餋A1區(qū)細(xì)胞50%左右的缺失，同時(shí)死亡率低。

但此種方法同樣存在個(gè)體差異大的問(wèn)題，同時(shí)，術(shù)后存活率較低，被燒灼阻斷的椎動(dòng)脈不可再通，改變了正常的解剖結(jié)構(gòu)，影響再灌注的腦血流量，造成再灌注不完全。我們所采取的3-VO法操作簡(jiǎn)便，因?yàn)樵贑57BL/6小鼠體內(nèi)，基底動(dòng)脈位于枕骨大孔和第一頸椎之間，位置明顯，因而可提高實(shí)驗(yàn)成功率，為相關(guān)腦血管病動(dòng)物模型的制作提供更易于操作的方法和思路。

針對(duì)建立全腦缺血再灌注模型的實(shí)驗(yàn)方法有很多種。Eklof等在1972年就提出了雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎的全腦缺血再灌注模型，然而這種方法個(gè)體差異大，造成的病理?yè)p傷不穩(wěn)定。當(dāng)前更流行的是四血管阻斷法（4-VO），即在電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈造成其永久性閉塞的情況下，結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，松開(kāi)結(jié)扎線后可實(shí)施再灌注研究。

〔責(zé)任編輯：李錦雯〕