摘要：米糠是我國第一大糧食品種稻谷加工過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，為了提高米糠資源的利用價值，本文以枯草芽孢桿菌為菌種，研究米糠發(fā)酵制備活性肽的條件，并對活性肽的抗氧化活性進行評價。結(jié)果表明：當枯草芽孢桿菌接種量為5%、發(fā)酵時間為48小時、發(fā)酵溫度為36℃、pH8時，米糠發(fā)酵液中水解度較高，達到了21.74%?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵制備的米糠活性肽具有較強的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和超氧陰離子清除能力。此外，米糠活性肽富含Asp和Glu，并包含了6種人體必需氨基酸?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵具有提高米糠功能特性的潛力，本文的研究可為米糠的高值化利用提供一定依據(jù)。

關(guān)鍵詞：米糠 枯草芽孢桿菌 發(fā)酵

中圖分類號：TS229 文獻標識碼：A 文章編號：1672-5336（2014）20-0005-02

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種革蘭氏染色陽性菌，常作為生物發(fā)酵劑用于豆類蛋白質(zhì)水解制備氨基酸、多肽和氨類化合物[1][2]。然而，目前鮮有報道將枯草芽孢桿菌用于發(fā)酵米糠制備多肽?；诿卓返睦矛F(xiàn)狀和枯草芽孢桿菌水解蛋白的特性，本文利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵米糠制備抗氧化肽，提高米糠的附加值，為米糠的高值化利用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

（1）材料?？莶菅挎邨U菌，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；米糠（蛋白質(zhì)含量15.78%，脂肪含量17.84%，水分含量8.24，灰分含量9.07），當?shù)匾患掖竺准庸S。

（2）試劑。DPPH，sigma公司；鄰二氮菲、鄰苯三酚，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；鹽酸等試劑均為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

（3）儀器。生化培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；pH計，梅特勒托利儀器有限公司；可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

（1）發(fā)酵菌株種子液的制備。將兩環(huán)活化的菌種接入50ml種子培養(yǎng)基（蛋白胨1%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1%）中，37℃，120r/min，培養(yǎng)24h。

（2）米糠發(fā)酵。以發(fā)酵液的水解度為評價指標，研究接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和pH對米糠發(fā)酵制備活性肽的影響。將適量種子液接種至發(fā)酵液中，在一定的溫度下培養(yǎng)一定時間后，取發(fā)酵液進行水解度測定。研究某一變量時，其他因素的條件為：接種量5%、發(fā)酵時間48h、發(fā)酵溫度36℃、pH8。

水解度的測定：通過溶液中游離氨基含量的測定來計算水解度，游離氨基采用TNBS法進行測定[3]。

其中：Lt表示發(fā)酵一段時間后發(fā)酵液中的游離氨基含量；L0表示發(fā)酵前溶液中的游離氨基含量；Lmax表示米糠中蛋白完全水解后溶液的游離氨基含量。

（3）米糠活性肽的制備。將發(fā)酵液于4000r/min的速度下離心30min，上清液再進行過濾，凍干后即得到米糠活性肽粉末。

（4）米糠活性肽抗氧化性的測定。本文采用DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和超氧陰離子清除率對米糠多肽的抗氧化性進行評價，測定方法參照李艷紅的報道[4]。

（5）米糠抗氧化肽氨基酸組成測定。取10mg大豆多肽粉末，用10ml 6mol/L HCl于120℃水解24h，然后用氨基酸自動分析儀進行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌接種量對米糠發(fā)酵產(chǎn)物水解度的影響

枯草芽孢桿菌接種量對米糠發(fā)酵液水解度的影響如圖1，隨著接種量的增大，水解度先增大后趨于平緩，當接種量達到5%后，水解度無顯著性增長。接種量達到一定值后水解度無顯著性增長的原因可能是米糠中能被利用的蛋白質(zhì)已基本上被枯草芽孢桿菌分泌的酶系水解，所以接種量相對米糠達到飽和后再進一步增大，不會起到增加體系水解度的效果。

2.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵時間對米糠發(fā)酵產(chǎn)物水解度的影響

枯草芽孢桿菌發(fā)酵時間對米糠發(fā)酵液水解度的影響如圖2所示，隨著發(fā)酵時間的增加，水解度起初顯著增長，當發(fā)酵時間達到48h后，水解度達到最大值，發(fā)酵時間進一步延長對水解度沒有明顯的影響。發(fā)酵后期水解度趨于平緩的原因可能是發(fā)酵后期枯草芽孢桿菌逐步衰亡、分泌的水解酶很少，此外，發(fā)酵后期發(fā)酵體系的整體環(huán)境不利于酶的水解作用。

2.3 溫度對枯草芽孢桿菌發(fā)酵米糠水解度的影響

枯草芽孢桿菌發(fā)酵溫度對米糠發(fā)酵液水解度的影響如圖3，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液的水解度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當發(fā)酵溫度為36℃時，發(fā)酵液中水解度達到最大值。可能的原因是在此溫度下，枯草芽孢桿菌的生長速度最快，分泌的蛋白質(zhì)水解酶最多，因而米糠發(fā)酵液中蛋白降解物最多，即水解度值最大。

2.4 米糠活性肽的抗氧化活性評價

枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備的米糠活性肽抗氧化性結(jié)果如表1所示，米糠活性肽具有較好的抗氧化活性，其中清除DPPH自由基能力的IC50值為7.53mg/mL，清除羥自由基能力的IC50值為6.48mg/mL，清除超氧陰離子能力的IC50值為5.74mg/mL。因此，枯草芽孢桿菌發(fā)酵可作為一種制備米糠抗氧化肽的有效手段。

3 結(jié)論

本文研究了枯草芽孢桿菌發(fā)酵因素對發(fā)酵液水解度的影響：隨著接種量和發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液水解度先增加后趨于平緩；隨著發(fā)酵溫度和pH值的增加，發(fā)酵液水解度呈先增加后減少的趨勢。在枯草芽孢桿菌接種量5%、發(fā)酵時間48h、發(fā)酵溫度36℃和pH8的發(fā)酵條件下，發(fā)酵液水解度達到了21.74%?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵制備的米糠活性肽富含Asp和Glu，包含了6種人體必需氨基酸，且具有較強的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和超氧陰離子清除能力，是一種頗具潛力的活性肽營養(yǎng)補充劑。

參考文獻

[1]張友維.枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生粕制備抗氧化肽的研究[D].江南大學(xué)，2012.

[2]Chung YC，Chang CT，Chao WW，et al. Antioxidant activity and safety of 50% ethanolic extract from red bean fermented by Bacillus subtilis IMR-NK1[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（8）：2454-2458.

[3]Jamdar，S.，Rajalakshmi， V.， Pednekar， M.，et al. Influence of degree of hydrolysis on functional properties，antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate[J].Food Chemistry，2010，121（1），178-184.

[4]李艷紅.鷹嘴豆蛋白酶解物的制備及其抗氧化肽的研究[D].江南大學(xué)，2008.