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        黃芩水煎液及聯(lián)合硫酸慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的體外影響

        2014-04-29 00:00:00田芳
        藥物與人 2014年7期

        摘要:目的: 研究黃芩水煎液體外對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的影響及其與硫酸慶大霉素的協(xié)同殺菌效果。 方法: 采用對(duì)倍稀釋法和MTT法檢測(cè)黃芩水煎液對(duì)銅綠假單胞菌最低抑菌濃度(MIC)及其生物膜MIC(SMIC)的作用,及其與硫酸慶大霉素協(xié)同的效果。 結(jié)果: 黃芩水煎液對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為1.95mg/ml, SMIC為31.25mg/ml,黃芩水煎液濃度在3.93mg/ml或以上時(shí)硫酸慶大霉素有明顯的抗菌協(xié)同作用。 結(jié)論: 黃芩水煎液體外對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的形成有較為明顯的抑制作用,與硫酸慶大霉素聯(lián)合用藥有一定的抗菌協(xié)同作用。

        關(guān)鍵詞:黃芩水煎液;銅綠假單胞菌;生物膜

        【中圖分類號(hào)】

        R917 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1002-3763(2014)07-0072-01

        1 前言

        銅綠假單胞菌是引起粘膜和創(chuàng)傷感染最常見(jiàn)的革蘭氏陰性菌,其極易形成生物膜,產(chǎn)生耐藥性。在國(guó)內(nèi)研究表明,清熱解毒藥物中的某些藥物對(duì)治療慢性感染有較好的效果。為了更多的發(fā)掘出抗銅綠假單胞菌生物膜的藥物,本課題從清熱解毒藥物中選取黃芩,研究其對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的影響,以及與抗生素合用的協(xié)同作用,為黃芩抗銅綠假單胞菌生物膜和聯(lián)合硫酸慶大霉素用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        2 材料與儀器

        2.1 材料:銅綠假單胞菌1株,由安徽中醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室于臨床分離獲得,并經(jīng)鑒定。黃芩100 g,購(gòu)于國(guó)泰大藥房。水煎2次,合并濃縮成50%濃度藥液(含生藥500mg/ml)。硫酸慶大霉素注射液,80mg/2ml(湖北同濟(jì)奔達(dá)鄂北制藥有限公司)。胰酶大豆肉湯(杭州微生物試劑有限公司)。四甲基偶氮唑鹽(MTT,Sigma公司),二甲基亞砜(DMSO,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所,分析純)。

        2.2 檢測(cè)儀器:318酶標(biāo)儀(上海三科儀器有限公司),96孔微量培養(yǎng)板(杭州生友生物技術(shù)有限公司),DPH-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)。倒置顯微鏡(OLYMPUS C×41)

        3 方法

        3.1 細(xì)菌計(jì)數(shù):菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌濃度:2.98×1014CFU/ml;調(diào)整濃度至2.98×105 CFU/ml、2.98×109 CFU/ml,備用。

        3.2 黃芩水煎液對(duì)銅綠假單胞菌MIC的測(cè)定:依據(jù)NCCLS 的M27- A 方案[3],將黃芩水煎液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個(gè)濃度梯度:500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml,分別加入96孔板,100μl/孔,每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔。加入調(diào)整至2.98×109CFU/ml菌體的混懸液100μl,37℃培養(yǎng)48h,接種于無(wú)菌固體培養(yǎng)皿中,37℃培養(yǎng)24h,以無(wú)菌生長(zhǎng)的最小藥物稀釋度作為銅綠假單胞菌的MIC。

        3.3 黃芩水煎液對(duì)銅綠假單胞菌SMIC:將100μl調(diào)整至2.98×105CFU/ml的細(xì)菌懸浮液分別加入96孔板,37℃培養(yǎng)48h,使銅綠假單胞菌完全粘附于平底的96孔板表面,形成銅綠假單胞菌生物膜的結(jié)構(gòu)。生物膜形成后,棄去培養(yǎng)基及懸浮菌,用PBS洗3次,將黃芩水煎液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個(gè)濃度梯度:500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml,分別加入96孔板,100μl/孔,每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h,倒置顯微鏡下觀察其形成情況。MTT法檢測(cè)抑制生物膜的藥物濃度:即50μl的MTT溶液( 貯存液含5mg/ml PBS, 臨用前用預(yù)溫的0.15M PBS 按1∶5 稀釋) 加入每孔中, 37℃孵育5h。棄去含MTT 的培養(yǎng)基, PBS 洗3 遍, 加入DMSO 100μl, 振蕩5min, 在酶標(biāo)儀492nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。設(shè)未加藥孔為空白對(duì)照。

        3.4 硫酸慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌MIC的測(cè)定:將硫酸慶大霉素注射液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個(gè)濃度梯度:125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.25μg/ml,分別加入96孔板,100μl/孔, 每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔。加入調(diào)整至2.98×105CFU/ml菌體的混懸液,100μl/孔。37℃培養(yǎng)48h, 接種于無(wú)菌固體培養(yǎng)皿中,37℃培養(yǎng)24h,以無(wú)菌生長(zhǎng)的最小藥物稀釋度作為銅綠假單胞菌的MIC。

        3.5 黃芩水煎液聯(lián)合硫酸慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌的MIC:將黃芩水煎液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個(gè)濃度梯度:500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml,分別加入96孔板,50μl/孔, 每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔。加入濃度調(diào)整為0.98μg/ml的硫酸慶大霉素注射液,50μl/孔。加入調(diào)整至2.98×109CFU/ml菌體的混懸液100μl,37℃培養(yǎng)48h, 接種于無(wú)菌固體培養(yǎng)皿中,37℃培養(yǎng)24h,以無(wú)菌生長(zhǎng)的最小藥物稀釋度作為銅綠假單胞菌的MIC。觀察其是否有抗菌協(xié)同作用。

        4 結(jié)果

        4.1 黃芩水煎液、硫酸慶大霉素、黃芩水煎液聯(lián)合硫酸慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌MIC:

        由表1可知,黃芩水煎液與硫酸慶大霉素聯(lián)合用藥有一定的抗銅綠假單胞菌協(xié)同作用。

        4.2 黃芩水煎液對(duì)銅綠假單胞菌SMIC: 經(jīng)MTT法檢測(cè),黃芩水煎液對(duì)銅綠假單胞菌SMIC為31.25mg/ml。倒置顯微鏡下觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。

        圖1 倒置顯微鏡下觀察銅綠假單胞菌的生物膜情況(×4000)

        a.對(duì)照孔,b.銅綠假單胞菌培養(yǎng)24h(未形成生物膜),c. 銅綠假單胞菌培養(yǎng)48h(形成生物膜),d.藥物濃度31.25 mg/ml作用后銅綠假單胞菌的生物膜,e. 藥物濃度125mg/ml作用后銅綠假單胞菌的生物膜

        由上可知,黃芩水煎液藥物濃度在3.93mg/ml以下時(shí)對(duì)銅綠假單胞菌無(wú)顯著性抑制作用;藥物濃度達(dá)到3.93mg/ml或以上時(shí)抑制效果較為明顯。

        5 討論

        為了從中藥中發(fā)掘具有抗銅綠假單胞菌BF的藥物,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究清熱解毒藥中的黃芩在體外對(duì)銅綠假單胞菌BF的影響,來(lái)尋找抗銅綠假單胞菌BF的更為有效的新藥。結(jié)果顯示,黃芩水煎液對(duì)銅綠假單胞菌懸浮菌的最低抑菌濃度(MIC)為1.95mg/ml,對(duì)生物膜的SMIC為31.25mg/ml,黃芩水煎液濃度在0.98mg/ml或以上時(shí)對(duì)硫酸慶大霉素有協(xié)同作用。

        黃芩水煎液聯(lián)合硫酸慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌作用的結(jié)果表明,黃芩水煎液與硫酸慶大霉素聯(lián)合用藥有一定的協(xié)同作用,其產(chǎn)生協(xié)同作用的機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,生物膜是黃芩抗銅綠假單胞菌的作用靶點(diǎn)之一,其是否有其它靶點(diǎn)值得進(jìn)一步研究。

        參考文獻(xiàn)

        [1] 彭程,肖永紅.大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的作用[J]. 中國(guó)抗感染化療雜志,2001,1(1):7-9.

        [2] 杜虎 ,陳在賢.氟喹諾酮類藥物對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的清除效應(yīng)[J]. 重慶醫(yī)學(xué),2005,34(4):592-594.

        [3] National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1997. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts: approved standard. NCCLS document M27- A. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa.

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