摘要：目的： 研究黃芩水煎液體外對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的影響及其與硫酸慶大霉素的協(xié)同殺菌效果。 方法： 采用對(duì)倍稀釋法和MTT法檢測(cè)黃芩水煎液對(duì)銅綠假單胞菌最低抑菌濃度（MIC）及其生物膜MIC（SMIC）的作用，及其與硫酸慶大霉素協(xié)同的效果。 結(jié)果： 黃芩水煎液對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為1.95mg/ml， SMIC為31.25mg/ml，黃芩水煎液濃度在3.93mg/ml或以上時(shí)硫酸慶大霉素有明顯的抗菌協(xié)同作用。 結(jié)論： 黃芩水煎液體外對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的形成有較為明顯的抑制作用，與硫酸慶大霉素聯(lián)合用藥有一定的抗菌協(xié)同作用。

關(guān)鍵詞：黃芩水煎液；銅綠假單胞菌；生物膜

【中圖分類號(hào)】

R917 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1002-3763（2014）07-0072-01

1 前言

銅綠假單胞菌是引起粘膜和創(chuàng)傷感染最常見(jiàn)的革蘭氏陰性菌，其極易形成生物膜，產(chǎn)生耐藥性。在國(guó)內(nèi)研究表明，清熱解毒藥物中的某些藥物對(duì)治療慢性感染有較好的效果。為了更多的發(fā)掘出抗銅綠假單胞菌生物膜的藥物，本課題從清熱解毒藥物中選取黃芩，研究其對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的影響，以及與抗生素合用的協(xié)同作用，為黃芩抗銅綠假單胞菌生物膜和聯(lián)合硫酸慶大霉素用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2 材料與儀器

2.1 材料：銅綠假單胞菌1株，由安徽中醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室于臨床分離獲得，并經(jīng)鑒定。黃芩100 g，購(gòu)于國(guó)泰大藥房。水煎2次，合并濃縮成50%濃度藥液（含生藥500mg/ml）。硫酸慶大霉素注射液，80mg/2ml（湖北同濟(jì)奔達(dá)鄂北制藥有限公司）。胰酶大豆肉湯（杭州微生物試劑有限公司）。四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純）。

2.2 檢測(cè)儀器：318酶標(biāo)儀（上海三科儀器有限公司），96孔微量培養(yǎng)板（杭州生友生物技術(shù)有限公司），DPH-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）。倒置顯微鏡（OLYMPUS C×41）

3 方法

3.1 細(xì)菌計(jì)數(shù)：菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌濃度：2.98×1014CFU/ml；調(diào)整濃度至2.98×105 CFU/ml、2.98×109 CFU/ml，備用。

3.2 黃芩水煎液對(duì)銅綠假單胞菌MIC的測(cè)定：依據(jù)NCCLS 的M27- A 方案^[3]，將黃芩水煎液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個(gè)濃度梯度：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml，分別加入96孔板，100μl/孔，每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔。加入調(diào)整至2.98×109CFU/ml菌體的混懸液100μl，37℃培養(yǎng)48h，接種于無(wú)菌固體培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24h，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最小藥物稀釋度作為銅綠假單胞菌的MIC。

3.3 黃芩水煎液對(duì)銅綠假單胞菌SMIC：將100μl調(diào)整至2.98×105CFU/ml的細(xì)菌懸浮液分別加入96孔板，37℃培養(yǎng)48h，使銅綠假單胞菌完全粘附于平底的96孔板表面，形成銅綠假單胞菌生物膜的結(jié)構(gòu)。生物膜形成后，棄去培養(yǎng)基及懸浮菌，用PBS洗3次，將黃芩水煎液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個(gè)濃度梯度：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml，分別加入96孔板，100μl/孔，每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h，倒置顯微鏡下觀察其形成情況。MTT法檢測(cè)抑制生物膜的藥物濃度：即50μl的MTT溶液（ 貯存液含5mg/ml PBS， 臨用前用預(yù)溫的0.15M PBS 按1∶5 稀釋） 加入每孔中， 37℃孵育5h。棄去含MTT 的培養(yǎng)基， PBS 洗3 遍， 加入DMSO 100μl， 振蕩5min， 在酶標(biāo)儀492nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。設(shè)未加藥孔為空白對(duì)照。

3.4 硫酸慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌MIC的測(cè)定：將硫酸慶大霉素注射液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個(gè)濃度梯度：125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.25μg/ml，分別加入96孔板，100μl/孔， 每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔。加入調(diào)整至2.98×105CFU/ml菌體的混懸液，100μl/孔。37℃培養(yǎng)48h， 接種于無(wú)菌固體培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24h，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最小藥物稀釋度作為銅綠假單胞菌的MIC。

3.5 黃芩水煎液聯(lián)合硫酸慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌的MIC：將黃芩水煎液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個(gè)濃度梯度：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml，分別加入96孔板，50μl/孔， 每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔。加入濃度調(diào)整為0.98μg/ml的硫酸慶大霉素注射液，50μl/孔。加入調(diào)整至2.98×109CFU/ml菌體的混懸液100μl，37℃培養(yǎng)48h， 接種于無(wú)菌固體培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24h，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最小藥物稀釋度作為銅綠假單胞菌的MIC。觀察其是否有抗菌協(xié)同作用。

4 結(jié)果

4.1 黃芩水煎液、硫酸慶大霉素、黃芩水煎液聯(lián)合硫酸慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌MIC：

由表1可知，黃芩水煎液與硫酸慶大霉素聯(lián)合用藥有一定的抗銅綠假單胞菌協(xié)同作用。

4.2 黃芩水煎液對(duì)銅綠假單胞菌SMIC： 經(jīng)MTT法檢測(cè)，黃芩水煎液對(duì)銅綠假單胞菌SMIC為31.25mg/ml。倒置顯微鏡下觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察銅綠假單胞菌的生物膜情況（×4000）

a.對(duì)照孔，b.銅綠假單胞菌培養(yǎng)24h（未形成生物膜），c. 銅綠假單胞菌培養(yǎng)48h（形成生物膜），d.藥物濃度31.25 mg/ml作用后銅綠假單胞菌的生物膜，e. 藥物濃度125mg/ml作用后銅綠假單胞菌的生物膜

由上可知，黃芩水煎液藥物濃度在3.93mg/ml以下時(shí)對(duì)銅綠假單胞菌無(wú)顯著性抑制作用；藥物濃度達(dá)到3.93mg/ml或以上時(shí)抑制效果較為明顯。

5 討論

為了從中藥中發(fā)掘具有抗銅綠假單胞菌BF的藥物，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究清熱解毒藥中的黃芩在體外對(duì)銅綠假單胞菌BF的影響，來(lái)尋找抗銅綠假單胞菌BF的更為有效的新藥。結(jié)果顯示，黃芩水煎液對(duì)銅綠假單胞菌懸浮菌的最低抑菌濃度（MIC）為1.95mg/ml，對(duì)生物膜的SMIC為31.25mg/ml，黃芩水煎液濃度在0.98mg/ml或以上時(shí)對(duì)硫酸慶大霉素有協(xié)同作用。

黃芩水煎液聯(lián)合硫酸慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌作用的結(jié)果表明，黃芩水煎液與硫酸慶大霉素聯(lián)合用藥有一定的協(xié)同作用，其產(chǎn)生協(xié)同作用的機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生物膜是黃芩抗銅綠假單胞菌的作用靶點(diǎn)之一，其是否有其它靶點(diǎn)值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

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