摘要：目的：為了更好的檢測(cè)干細(xì)胞中支原體污染的情況。方法：以本實(shí)驗(yàn)室2013年12月-2014年4月間培養(yǎng)的干細(xì)胞56份為研究對(duì)象，使用PCR方法對(duì)干細(xì)胞中的支原體污染情況進(jìn)行檢測(cè)，并使用支原體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)干細(xì)胞中支原體污染的情況及種類。比較PCR檢測(cè)方法與支原體檢測(cè)試劑盒的準(zhǔn)確性及特異性。結(jié)果： PCR檢測(cè)陽(yáng)性例數(shù)為21例，試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性例數(shù)為12例，而陽(yáng)性率分別為37.5%和21.4%。兩組間陽(yáng)性例數(shù)和陽(yáng)性率比較結(jié)果差異顯著（p<0.05）。復(fù)蘇的干細(xì)胞連續(xù)144小時(shí)之后，無(wú)論是PCR檢測(cè)還是試劑盒檢測(cè)，支原體的陽(yáng)性例數(shù)和陽(yáng)性率均高于72小時(shí)、48小時(shí)和24小時(shí)。而且在培養(yǎng)培養(yǎng)24小時(shí)或144小時(shí)之后，PCR檢測(cè)和試劑盒檢測(cè)干細(xì)胞支原體污染的陽(yáng)性例數(shù)和陽(yáng)性率情況比較結(jié)果差異顯著（p<0.05）。而培養(yǎng)48小時(shí)和72小時(shí)之后，PCR檢測(cè)和試劑盒檢測(cè)干細(xì)胞支原體污染的陽(yáng)性例數(shù)和陽(yáng)性率情況比較結(jié)果差異不顯著（p>0.05）。結(jié)論：PCR檢測(cè)方法較支原體試劑盒檢測(cè)方法具有更高的準(zhǔn)確率和敏感性。

關(guān)鍵詞：支原體；干細(xì)胞；PCR檢測(cè)

【中圖分類號(hào)】

R249 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1002-3763（2014）07-0029-01

近些年，干細(xì)胞對(duì)治療如糖尿病、神經(jīng)退行性疾病及骨關(guān)節(jié)疾病等疾病均有良好的應(yīng)用評(píng)價(jià)，并且很多研究人員和普通人希望干細(xì)胞能在更多的疾病治療領(lǐng)域發(fā)揮更為廣闊的應(yīng)用價(jià)值。人胚胎干細(xì)胞（hESCs， human embryonic stem cells）因其具有無(wú)限增殖能力和多向分化潛能而被作為研究干細(xì)胞的常用細(xì)胞類型[1，2]。細(xì)胞出現(xiàn)支原體污染是實(shí)驗(yàn)室中比較常見的現(xiàn)象，感染率一般為5-30%^[3]。有研究人員的研究結(jié)果顯示，支原體污染概率與細(xì)胞傳代次數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)性。本研究對(duì)干細(xì)胞感染支原體的情況進(jìn)行PCR檢測(cè)，并使用支原體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 所需試劑：

PCR 預(yù)混料（購(gòu)買自上海生工）；DL2000 DNAMarker（購(gòu)買自北京天根生物）；瓊脂糖為BD公司；支原體檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Lonza公司）；瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物（購(gòu)買自美國(guó)Promega公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器：

PCR擴(kuò)增儀（購(gòu)買自美國(guó)Biometra公司）；超低溫冰箱、恒溫CO2培養(yǎng)箱、高速低溫離心機(jī)（購(gòu)買自德國(guó)Thermo公司）；電子分析天平（購(gòu)買自上海分析儀器廠）；超純水儀（購(gòu)買自美國(guó)Millipore公司）；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀（購(gòu)買自北京六一儀器廠）；凝膠成像分析系統(tǒng)（購(gòu)買自美國(guó)Bio-RAD公司）；超凈工作臺(tái)（購(gòu)買自蘇州凈化設(shè)備公司）。

1.3 引物設(shè)計(jì)：

根據(jù)GenBank 收錄的支原體 Ala-PG8株、Ora-CH19299 株、Mho- BTS7株、Arg-G230 株、Fer-PG18株的序列，使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)出的引物是可以擴(kuò)增出以上5株支原體序列的通用引物。引物序列如下：

上游引物5’-CCAGCAGCCGCGGTATACATA- 3’

下游引物5’-GTGGACTACTAGGGTATCTAAT- 3’

1.4 干細(xì)胞的培養(yǎng)

1.4.1 Feeder的培養(yǎng)：

將本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后凍存的人成纖維細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，然后在培養(yǎng)皿中放置在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)12h后在培養(yǎng)液中加入濃度為10ug/ml的絲裂霉素C，共同培養(yǎng)2.5h。然后使用胰酶消化人成纖維細(xì)胞加入到6孔板中，這樣就形成了Feeder。

1.4.2 干細(xì)胞的培養(yǎng)：

將本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后凍存的人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，共分7次復(fù)蘇，每次2份細(xì)胞，并且在培養(yǎng)24、48、72、144小時(shí)之后取細(xì)胞樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，共計(jì)復(fù)蘇56次不同凍存批次和代數(shù)的人胚胎干細(xì)胞。將Feeder中的培養(yǎng)基換為人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，復(fù)蘇之后將細(xì)胞加入到Feeder之上，放置在4個(gè)不同的CO2培養(yǎng)箱中的不同位置進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.3 PCR檢測(cè)：

在培養(yǎng)24、48、72、144小時(shí)之后取細(xì)胞樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，首先使用移液器將培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的6孔板中的培養(yǎng)基吸除，使用PBS溶液清洗一次，使用胰酶將人胚胎干細(xì)胞消化下來(lái)，使用移液器將收集的人胚胎干細(xì)胞以2500rpm離心10min，然后使用500ul 的PBS溶液重懸細(xì)胞。放置在100水浴鍋中煮沸10min，以細(xì)胞懸液10ul為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和條件見表1和表2。

PCR擴(kuò)增之后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳之后在凝膠成像儀下觀察并保存結(jié)果。擴(kuò)增出條帶大小符合支原體DNA的為支原體污染樣品，如果沒有符合的條帶，則視為沒有支原體污染。

1.4.4 支原體試劑盒檢測(cè)： 取出1管Lonza支原體檢測(cè)瓶，在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)將培養(yǎng)好的干細(xì)胞培養(yǎng)液加入到支原體檢測(cè)瓶中，蓋好檢測(cè)瓶的蓋子，放入37℃水浴鍋中1h，觀察檢測(cè)結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)： 將所有獲得的結(jié)果使用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，兩組之間比較采用卡方檢驗(yàn)，當(dāng)p<0.05時(shí)顯示比較結(jié)果差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 支原體檢測(cè)結(jié)果： 使用兩種方法對(duì)干細(xì)胞中支原體污染的情況進(jìn)行檢測(cè)，每組均檢測(cè)56例，PCR檢測(cè)陽(yáng)性例數(shù)為21例，試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性例數(shù)為12例，而陽(yáng)性率分別為37.5%和21.4%。兩組間陽(yáng)性例數(shù)和陽(yáng)性率比較結(jié)果差異顯著（p<0.05）。詳細(xì)結(jié)果見表3。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間支原體檢測(cè)結(jié)果： 對(duì)復(fù)蘇后培養(yǎng)24、48、72和144小時(shí)的干細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測(cè)，結(jié)果顯示，復(fù)蘇的干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)144小時(shí)之后，無(wú)論是PCR檢測(cè)還是試劑盒檢測(cè)，支原體的陽(yáng)性例數(shù)和陽(yáng)性率均高于72小時(shí)、48小時(shí)和24小時(shí)。而且在培養(yǎng)144小時(shí)之后，PCR檢測(cè)和試劑盒檢測(cè)干細(xì)胞支原體污染的陽(yáng)性例數(shù)和陽(yáng)性率情況比較結(jié)果差異顯著（p<0.05）。培養(yǎng)24小時(shí)之后，PCR檢測(cè)和試劑盒檢測(cè)干細(xì)胞支原體污染的陽(yáng)性例數(shù)和陽(yáng)性率情況比較結(jié)果差異顯著（p<0.05）。而培養(yǎng)48小時(shí)和72小時(shí)之后，PCR檢測(cè)和試劑盒檢測(cè)干細(xì)胞支原體污染的陽(yáng)性例數(shù)和陽(yáng)性率情況比較結(jié)果差異不顯著（p>0.05）。詳細(xì)結(jié)果見表4。

3 討論

一般在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，支原體污染的情況不容易被發(fā)現(xiàn)，因?yàn)橹гw不像細(xì)菌污染一樣可以在顯微鏡下或肉眼進(jìn)行觀察。但是支原體污染后會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，以及細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)及蛋白合成等反面均造成一定影響，這樣就會(huì)對(duì)科研研究結(jié)果造成一定影響^[4]。以前常用的方法是采用瓊脂培養(yǎng)檢測(cè)支原體，通過(guò)觀察支原體的生長(zhǎng)特征來(lái)判斷細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中是否出現(xiàn)支原體污染的情況^[5]。但是這種經(jīng)典的方法所需的時(shí)間較長(zhǎng)。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中支原體污染檢測(cè)的方法還有使用電鏡檢測(cè)、熒光染色、雙酶分析法等，但這些方法的靈敏性較低，并且操作比較復(fù)雜，檢測(cè)需要較高的費(fèi)用。而PCR檢測(cè)支原體方法是近幾年得到應(yīng)用的新檢測(cè)方法，PCR檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，所需時(shí)間較短，并且具有很高的靈敏性。

本研究中，使用PCR檢測(cè)干細(xì)胞中支原體污染情況比實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測(cè)的靈敏度高。并且檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)，支原體污染的幾率越大。所以在干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)該對(duì)長(zhǎng)期培養(yǎng)的干細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的處理，以防支原體污染。PCR方法可以很好的檢測(cè)干細(xì)胞中支原體的存在情況。

對(duì)出現(xiàn)支原體污染的細(xì)胞的處理方法方法并不是很多，并不像臨床上治療支原體的方法豐富多樣[6，7]。所以在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)該時(shí)刻注意支原體污染的情況。如果胚胎干細(xì)胞出現(xiàn)支原體污染的情況，使用抗支原體的藥物對(duì)胚胎干細(xì)胞處理之后，對(duì)支原體的生長(zhǎng)短時(shí)間內(nèi)具有很好的控制作用，但是并不能將胚胎干細(xì)胞中支原體完全清除。并且出現(xiàn)支原體污染的胚胎干細(xì)胞會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)其他細(xì)胞株造成交叉感染，如果沒有更好的處理辦法，建議將出現(xiàn)支原體污染的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行妥善處理或者直接丟棄。

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