摘要：目的：探討與血管生成密切相關(guān)的肝癌干細(xì)胞標(biāo)志CD133和CD34在二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的小鼠肝癌組織中表達(dá)的變化。方法：采用二乙基亞硝胺和四氯化碳誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠肝癌，于16W后處死小鼠取正常肝組織，癌旁組織和癌組織。提取總RNA并采用Real time RT-PCR（SYBR Green）法來(lái)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志基因甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP），肝臟癌組織中CD133、CD34及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF） mRNA的表達(dá)。結(jié)果：C57BL/6J小鼠肝癌組織中AFP表達(dá)明顯升高（正常組，100±21.49；癌旁組織，161.55±38.59；癌組織，1175.79±325.47，P < 0.01）；與正常組比較（CD133，0.317±0.047；CD34， 0.067±0.007；VEGF，3.452±1.265），肝癌組織及癌旁組織中CD133、CD34和VEGF mRNA表達(dá)明顯升高，尤其是癌組織（CD133，0.881±0.121；CD34，0.147±0.020；VEGF，8.274±2.621；P < 0.01）。結(jié)論：二乙基亞硝胺及四氯化碳誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠肝癌發(fā)生過(guò)程中干細(xì)胞標(biāo)志CD133和CD34高表達(dá)，可能與新生血管有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞：二乙基亞硝胺；肝癌；CD133；CD34；血管生成

Expression of CD133 and CD 34 in diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma in mice

Xu Shangfu1， Jin Tao1， Wen Guorong2， Lu Yuanfu1， Liu jie1， Jin Hai2 （

Department of Pharmacology/The Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education， Zunyi Guizhou 563000， China； 2. Department of Digest the Affiliated Hospital of Zun Yi Medical College/Gastroenterology Institute of Guizhou， Zunyi Guizhou 563000， China）

Abstract：

Objective To discus the expression of liver cancer stem cell markers CD133 and CD34 in diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma in mice. Methods Hepatic carcinoma in mice was induced by diethylnitrosamine and carbon tetrachloride. Normal liver， the adjacent and cancer tissues of mice were collected at 16W. Total RNA was extracted and expression of alpha fetoprotein（AFP）， CD133， CD34 and vascular endothelial growth factor（VEGF） mRNA in liver cancer tissue were detected by Real time RT-PCR. Results Expression of AFP in hepatoma tissues of C56BL/6J mouse was significantly increased（normal group， 100±21.49， adjacent tissues， 161.55±38.59， cancer tissue， 1175.79±325.47，P < 0.01 ）. Compared with the normal group（CD133，0.317±0.047；CD34， 0.067±0.007；VEGF，3.452±1.265）， the relative mRNA levels of CD133、CD34 and VEGF in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues were significantly increased， especially in cancer tissue（CD133，0.881±0.121， CD34，0.147±0.020， VEGF，8.274±2.621， P < 0.01）. Conclusion The expression of cancer stem cell markers CD133 and CD34 were obviously increased in the liver cancer tissues of C56BL/6J mouse induced by diethylnitrosamine and carbon tetrachloride， and it may be closely related with angiogenesis.

Key words：Diethylnitrosamine， Liver cancer， CD133， CD34， angiogenesis

【中圖分類號(hào)】

R735.7 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1002-3763（2014）07-0002-02

肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），簡(jiǎn)稱肝細(xì)胞癌，是原發(fā)性肝癌的主要形式，是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。目前我國(guó)的發(fā)病人數(shù)約占全球的半數(shù)以上，是嚴(yán)重影響我國(guó)人民健康和生命的一大殺手[1-2]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與血液供應(yīng)有密切關(guān)系，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤的血管由周?chē)艹鲅溃ㄑ苌?，angiogenesis）和內(nèi)皮祖細(xì)胞的招募分化（血管發(fā)生，vasculogenesis）形成，近年來(lái)隨著對(duì)腫瘤干細(xì)胞的深入研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞可能是腫瘤組織血管生成的關(guān)鍵^[3]。本文通過(guò)二乙基亞硝胺和四氯化碳誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠發(fā)生肝癌，并檢測(cè)肝癌組織中腫瘤干細(xì)胞CD133和CD34的表達(dá)，探討其與原發(fā)性肝癌發(fā)生過(guò)程中血管生成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器：二乙基亞硝胺購(gòu)自天津化學(xué)試劑研究所；四氯化碳購(gòu)自阿拉丁化學(xué)試劑公司；提取總RNA用的Trizol購(gòu)自大連寶生物公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems公司；PCR用SYBR Green預(yù)混液購(gòu)自BIO-RAD公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為BIO-RAD公司產(chǎn)品（型號(hào)為CFX connect）；德國(guó)Eppendoff多功能梯度PCR儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：健康雄性C57BL/6J小鼠，體重18-22g，共24只，由重慶市第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK（渝）2012-0001）。于遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為兩組，正常組（12只）和肝癌組（12只）。

1.3 原發(fā)性肝癌的誘導(dǎo)與取材：肝癌組小鼠以100mg/kg二乙基亞硝胺腹腔注射1次；3天后以20%四氯化碳（溶于橄欖油）灌胃，灌胃劑量為0.05ml/10g，2次/周；于第3周再次以50 mg/kg二乙基亞硝胺腹腔注射1次，同時(shí)給予含有9%乙醇的飲用水；第4周開(kāi)始四氯化碳劑量調(diào)整致0.08 ml/10g直至16周^[4]；正常組給予滅菌普通水。16周末脫頸處死小鼠取正常肝組織，癌旁組織及癌組織。

1.4 Real time RT-PCR檢測(cè)肝癌組織AFP、CD133、CD34和VEGF mRNA的表達(dá) 肝組織100mg采用Trizol抽屜總RNA，紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)總RNA的濃度和質(zhì)量，以260/280的比值在1.8-2.0之間認(rèn)為RNA較純并可用于下一步實(shí)驗(yàn)；調(diào)整總RNA濃度為50ng/ul進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（37℃，15min；85℃，5sec），所得cDNA進(jìn)行SYBR Green PCR反應(yīng)（退火溫度為60℃），PCR反應(yīng)以beta actin作為內(nèi)參照，所用特異性引物如表1；結(jié)果采用相對(duì)定量法進(jìn)行分析^[5]。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織腫瘤標(biāo)志物AFP mRNA的表達(dá)：如圖1顯示，C57BL/6J小鼠制模后16W大體肝臟標(biāo)本可見(jiàn)散在的大小不等的結(jié)節(jié)，肝臟表面凸凹不平。高特異性和靈敏性的原發(fā)性肝癌標(biāo)志物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）mRNA在癌組織中相對(duì)表達(dá)顯著增高（正常組，100±21.49；癌旁組織，161.55±38.59；癌組織，1175.79±325.47），以均數(shù)計(jì)算升高11倍（P < 0.01）。

2.2 肝癌組織中CD133、CD34和VEGF mRNA的表達(dá)：結(jié)果顯示（圖2、3、4）二乙基亞硝胺和四氯化碳誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠肝癌組織及癌旁組織中CD133、CD34和VEGF mRNA表達(dá)明顯升高（CD133，正常組0.317±0.047，癌旁組織0.641±0.098，癌組織0.881±0.121；CD34，正常組0.067±0.007，癌旁組織0.096±0.014，癌組織0.147±0.020；VEGF，正常組3.452±1.265，癌旁組織4.794±0.665，癌組織8.274±2.621），尤其在癌組織中3個(gè)基因均稱現(xiàn)基因高表達(dá)現(xiàn)象（P < 0.01）。

3 討論

原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未確定，目前認(rèn)為與肝硬化、病毒性肝炎以及黃曲霉素等化學(xué)致癌物質(zhì)和環(huán)境因素有關(guān)。二乙基亞硝胺對(duì)肝臟的作用從肝細(xì)胞損傷再生到肝硬化直至癌變，與人類肝癌的發(fā)生類似，是成熟的肝癌化學(xué)誘導(dǎo)劑^[6]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)二乙基亞硝胺、四氯化碳聯(lián)合用藥16周后肝臟腫瘤發(fā)生，并且特異性肝癌標(biāo)志物AFP的表達(dá)在肝癌組織中顯著升高，說(shuō)明C57BL/6J小鼠原發(fā)性肝癌誘導(dǎo)成功。

隨著腫瘤干細(xì)胞的研究不斷深入，認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤中具有自我更新能力，可以無(wú)限增殖和分化潛能的細(xì)胞，其具有高致瘤性，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用^[2]。肝癌干細(xì)胞密切相關(guān)的表面標(biāo)記物尚沒(méi)有特異性標(biāo)志，但主要有OV6、CD133、CD34、CD90、CD44、EpCAM、CD13等^[6]。其中CD133是肝癌干細(xì)胞的重要標(biāo)志分子之一，研究就發(fā)現(xiàn)無(wú)論是肝癌細(xì)胞系，還是肝炎后肝硬化組織、癌旁組織均有CD133抗原的表達(dá)，在肝癌細(xì)胞系中CD133陽(yáng)性率可達(dá)到47%，且成瘤率非常高[7-9]。CD34特異性血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，在肝癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率較高，而VEGF主要可通過(guò)與其受體結(jié)合參與血管形成[10-11]。文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤干細(xì)胞是影響血管生成的關(guān)鍵，也有研究認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞與血管生成擬態(tài)有關(guān)^[2]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，二乙基亞硝胺和四氯化碳誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠肝癌組織中CD133、CD34和VEGF 的mRNA均呈現(xiàn)高表達(dá)，并且CD133的表達(dá)與CD34和VEGF呈正相關(guān)，提示在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物原發(fā)性肝癌模型中，腫瘤干細(xì)胞與肝癌組織血管形成有密切關(guān)系。

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