李峰　苗立中　沈志強

摘 要：從山東省某蛋雞場發(fā)病雞群中分離到一株細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)特性觀察、生化試驗、V因子生長試驗、致病性試驗和PCR試驗，證實分離菌為一株致病性副雞嗜血桿菌，血清型鑒定該菌為A型。藥物敏感性試驗表明分離菌對頭孢噻肟、頭孢曲松、丁胺卡那霉素高度敏感，對硫酸新霉素、強力霉素中度敏感，對磺胺間甲氧嘧啶鈉、環(huán)丙沙星、慶大霉素耐藥。

關(guān)鍵詞：A型；副雞嗜血桿菌；傳染性鼻炎；分離鑒定近日，山東某養(yǎng)殖場一批140日齡左右的雞群出現(xiàn)面部單側(cè)或雙側(cè)腫脹，流鼻涕、打噴嚏癥狀，并且2d內(nèi)產(chǎn)蛋率下降約10個百分點，場主即攜帶發(fā)病雞到我院獸醫(yī)診斷中心就診。經(jīng)病原分離、生化試驗、V因子生長試驗、致病性試驗和PCR鑒定，確診為A型副雞嗜血桿菌感染，經(jīng)藥敏試驗，選擇敏感藥物治療，較快控制了疫情。現(xiàn)將試驗情況報告如下。

1 材料

1.1 病料 3只發(fā)病雞，山東某養(yǎng)殖場提供。

1.2 試驗雞 10只30日齡非免疫健康雞，由山東綠都生物科技有限公司實驗動物中心提供。

1.3 培養(yǎng)基 雞鮮血瓊脂、雞血清肉湯瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，按文獻方法[1]自制。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)副雞嗜血桿菌陽性血清 山東省濱州獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室提供。

1.5 細(xì)菌微量生化反應(yīng)管 購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.6 藥敏試驗紙片 購自北京天壇藥物技術(shù)開發(fā)公司。

1.7 PCR擴增引物 參照GenBank中副雞嗜血桿菌的基因序列，借助Primer5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計1對引物。

A上游5-GCGGGACACGATGTGGCTAT-3，B下游5-TGGCGATGACGTTCCTCAAT-3，由上海生工合成。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將病雞處死，用棉拭子沾取眶下竇內(nèi)容物，分別劃線接種于雞鮮血瓊脂、雞血清肉湯瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，置5%的CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)16～24h后觀察，挑取單個可疑菌落接種到含血清的雞肉湯培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)，同時涂片，革蘭氏染色、鏡檢。

2.2 生化鑒定 將純化好的細(xì)菌劃線培養(yǎng)后，取單個菌落接種于生化反應(yīng)管內(nèi)，并在微量發(fā)酵管中分別加入0.2ml的雞血清和濃度為1%的輔酶I 0.2ml，用蠟封口，倒置于放有脫脂棉的平皿內(nèi)，37℃厭氧罐中培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。

2.3 V因子生長試驗 用接種環(huán)蘸取新鮮的肉湯培養(yǎng)物，在無NAD的雞血清肉湯瓊脂上劃8～10條橫線，再用金黃色葡萄球菌劃一豎線，翻轉(zhuǎn)平板置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～20h，觀察分離物是否出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象。

2.4 致病性試驗 將純培養(yǎng)的菌落接種于雞血清肉湯中培養(yǎng)24h，接種30日齡齡非免疫健康小公雞6只，每只雞各取0.2ml培養(yǎng)物進行眶下竇接種，同時滴鼻（1×108CFU/ml）；同時用生理鹽水接種4只試驗雞，0.2ml/只，作為對照組。分別隔離飼養(yǎng)觀察。對出現(xiàn)典型癥狀的雞，無菌采取眶下竇分泌物，進行本菌的回收培養(yǎng)。

2.5 PCR鑒定 以分離菌雞血清雞肉湯純培養(yǎng)物2m作為模板進行PCR鑒定。采用25反應(yīng)體系（超純水17μl、10×PCR buffer 2.5μl、dNTP 2.0μl、A和B各1μl、模板1μl、rTap酶0.5μl）于95℃變性5min，25個循環(huán)（94℃1min，53.9℃1min，72℃2min）最后72℃延伸10min。1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

2.6 血清型鑒定 用常規(guī)凝集試驗方法，取純化菌株與A、B、C型副雞嗜血桿菌的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進行凝集試驗。

2.7 藥敏試驗 用紙片法進行，對分離菌用頭孢噻肟、頭孢曲松、丁胺卡那霉素、硫酸新霉素、強力霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、環(huán)丙沙星、慶大霉素共八種藥物在雞肉湯瓊脂平板上，按常規(guī)紙片法進行了藥敏試驗。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果 無菌接種培養(yǎng)基24h后，在麥康凱瓊脂、鮮血瓊脂平板上，均無菌生長。在雞血清肉湯瓊脂上長出灰白色露滴狀、邊緣整齊、表面光滑、有輕度隆起、粘液狀、濕潤、有光澤、不透明、邊緣有虹彩的菌落。挑取菌落涂片，染色、鏡檢，為革蘭氏陰性球桿菌，單個、成對或多個堆積在一塊。

3.2 生化試驗結(jié)果 分離菌能夠發(fā)酵葡萄糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖，不發(fā)酵乳糖、菊糖、鼠李糖、山梨醇、和肌醇，過氧化氫酶反應(yīng)陰性，硫化氫試驗陰性，吲哚試驗陰性，硝酸鹽還原試驗陽性。

3.3 V-因子需求試驗結(jié)果 培養(yǎng)24h后觀察，在靠近金黃色葡萄球菌劃線處，該菌菌落生長密集，比較大，成半透明狀，遠離金黃色葡萄球菌處的菌落則生長稀少，也比較小，呈較典型的“衛(wèi)星現(xiàn)象”。

3.4 致病性試驗結(jié)果 試驗雞接種后5d開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，到第7天流鼻液，不同程度的單側(cè)臉部和眼瞼腫脹，個別雞有呼吸困難。對照組雞正常。從人工感染發(fā)病雞的眶下竇的分泌物中均能分離到本菌。

3.5 PCR鑒定 分離菌DNA的提取由BioTeke基因組DNA提取試劑盒提取（按照試劑盒說明書提?。?，以DNA基因組為模板PCR擴增，獲得了939bp的目的陽性條帶（如圖1）。

3.6 血清型鑒定結(jié)果 分離菌能夠與A型雞副嗜血桿菌的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清在3～5min內(nèi)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，且與B、C型雞副嗜血桿菌的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清無凝集發(fā)生。同時陽性對照和陰性對照均成立。

3.7 藥敏試驗結(jié)果 分離菌對頭孢噻肟、頭孢曲松、丁胺卡那霉素高度敏感，對硫酸新霉素、強力霉素中度敏感，對磺胺間甲氧嘧啶鈉、環(huán)丙沙星、慶大霉素耐藥。

4 小結(jié)與討論

4.1 根據(jù)臨床癥狀、細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗、V因子生長試驗、致病性試驗和PCR試驗及血清型鑒定，證明病原為A型副雞嗜血桿菌。通過藥敏試驗，選擇丁胺卡那霉素用于該場治療，在短時間內(nèi)有效控制了疫情。

4.2 副雞嗜血桿菌主要導(dǎo)致傳染性鼻炎臨床癥狀主要特征為流鼻涕、打噴嚏、單側(cè)或雙側(cè)眼瞼水腫，并能導(dǎo)致產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量下降10%～40%不等，若與其他病毒性疾病并發(fā)，死亡率具增高趨勢[2]。

4.3 副雞嗜血桿菌的培養(yǎng)需要V因子，由于葡萄球菌具有產(chǎn)生V因子的特性。所以常利用與葡萄球菌同培養(yǎng)的方式，以是否產(chǎn)生“衛(wèi)星現(xiàn)象”作為該菌鑒定的重要依據(jù)[3]。本試驗符合這一特性。

4.4 按Page的分型方法，副雞嗜血桿菌可分為A、B和C三個血清型，我國于1987年首次在北京分離到副雞嗜血桿菌[4]，目前A、B和C三個血清型已均有報道[5-7]。而目前我國批準(zhǔn)使用疫苗多為A、C型二價疫苗，所以常見病例多是由于未正常免疫或者是由于新的血清型的出現(xiàn)導(dǎo)致免疫失敗引起的。因此，研制開發(fā)新的含三種血清型的疫苗是提高防控本病的有效手段。

參考文獻：

[1] 陳天壽.微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M].第一版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社.1995，239-240.

[2] B.W卡爾尼克.禽病學(xué)[M].第十版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社.1999，218-234.

[3] 刁有祥. 禽病學(xué).北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社.2008，217-223.

[4] 馮文達.北京及傳染性鼻炎病原菌的分離鑒定[J].微生物學(xué)通報，1987，（5）：216～219.

[5] 苗得園，孫惠玲，陳曉峰，等.副雞嗜血桿菌的分離鑒定及我國雞傳染性鼻炎的流行狀況分析[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2006，28（4）：392-395.

[6] 張培君，苗得園，龔玉梅，等.B型雞副嗜血桿菌的分離鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2003，25（1）：56～58.

[7] 苗立中，沈志強，王艷，等.副雞禽桿菌河南株的分離及PCR鑒定[J].畜牧與獸醫(yī)，2010，2：66-68.