林小江　周世水

摘要 [目的]選育釀造低甲醇高總酯蒸餾酒的釀酒酵母菌株。[方法]利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，對低甲醇釀酒酵母與高總酯釀酒酵母進(jìn)行融合。[結(jié)果]選育出的酵母菌種釀造蒸餾酒中的相對甲醇含量為145.31 mg/L，比初始低甲醇菌株降低了22.8%，總酯含量為0.79 g/L，增加了83.7%。[結(jié)論] 原生質(zhì)體融合法成功選育出低甲醇高總酯的釀酒酵母菌株。

關(guān)鍵詞 原生質(zhì)體融合；蒸餾酒；甲醇；總酯

中圖分類號 S609.9；TS261.1；TS262.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）13-04050-01

Abstract [Objective] Screening Saccharomyces cerevisiae of brewing distilled liquor with low methanol and high total esters. [Method] Technology of protoplast fusion was used to fusing Saccharomyces cerevisiae of low methanol and Saccharomyces cerevisiae of high total esters. [Result] The methanol was 145.31 mg/L in the distilled liquor fermented by protoplast fusion， decreasing 22.8% than strain of low methanol. The total ester was 0.79 g/L， increasing 83.7%. [Conclusion] The Saccharomyces cerevisiae of low methanol and high total esters was obtained by technology of protoplast fusion.

Key words Protoplast fusion； Distilled liquor； Methanol； Total esters

釀造酒中都含有一定濃度的甲醇，其中約50%甲醇來源于發(fā)酵原料中的果膠質(zhì)、纖維素經(jīng)水解產(chǎn)生，另外50%甲醇來源于酵母代謝甘氨酸生成[1]。由于甲醇對人體來說是一種有害物質(zhì)，因此，國標(biāo)對酒中甲醇有嚴(yán)格的規(guī)定，如以糧食為原料釀造的蒸餾酒中相對甲醇含量（按酒精度60%vol計(jì)算）不得超過400 mg/L，薯干類原料的蒸餾酒中不得超過1 200 mg/L[2]。

酯是中國白酒香味的主要來源之一，其含量和種類直接影響到白酒的品質(zhì)，且受到釀酒酵母、生香酵母等微生物發(fā)酵的影響。因此，筆者采用原生質(zhì)體融合技術(shù)[3-4]篩選出1株既能提高總酯、又降低甲醇的酵母融合菌株，應(yīng)用到釀酒上不僅能提高酒的安全性和口感品質(zhì)，而且簡化生產(chǎn)操作，將具有很好的開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。低甲醇釀酒酵母、高酯香酵母，華南理工大學(xué)生物學(xué)院選育保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基（YPD）：葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨10 g/L；固體完全培養(yǎng)基（CM）：YPD中添加15 g/L瓊脂；固體高滲完全培養(yǎng)基（HCM）： CM中添加170 g/L蔗糖。

1.1.3 主要儀器。氣相色譜儀：安捷倫 7890A 氣相色譜儀；氣相色譜柱：DBFFAP毛細(xì)管柱（30 m×0.53 m×1.00 μm），進(jìn)樣器：安捷倫 7694E 頂空進(jìn)樣器。

1.2 原生質(zhì)體融合菌株的制備

1.2.1 原生質(zhì)體的制備。將低甲醇酵母和濃香酵母單倍體接種至YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h。調(diào)節(jié)酵母濃度至107cfu/ml，取1 ml于1.5 ml離心管中，3 000 r/min離心10 min收集菌體，用HPBS洗滌離心2次，加入1 ml HPBS，預(yù)處理劑0.05 mol/L EDTA 2.5 ml、0.5 mol/L β巰基乙醇 0.2 ml，35 ℃預(yù)處理30 min，3 000 r/min離心5 min，用HPBS洗滌離心2次，再加入0.3 g/L蝸牛酶溶液1.0 ml，35 ℃水浴30 min。3 000 r/min離心10 min后再用HPBS洗滌離心2次，懸浮于HPBS中保存，并分別涂布到HCM平板和CM平板，28 ℃培養(yǎng)，若HCM上長出菌落而CM上無，表明已制備好原生質(zhì)體[5-6]。

1.2.2 原生質(zhì)體融合。分別取106 cfu/ml的低甲醇酵母原生質(zhì)體、濃香酵母原生質(zhì)體的菌懸液4 ml到培養(yǎng)皿中，30 W紫外燈20 cm處照射70 s，吸取1.0 ml菌懸液60 ℃保溫14 min。再分別取0.5 ml到5 ml離心管，加1.0 ml促融劑，32 ℃保溫40 min，4 000 r/min離心10 min，用HPBS洗滌離心2次，取0.1 ml涂布于HCM上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d[7]。

1.2.3 融合菌株的發(fā)酵。挑取平板上長出的多個(gè)菌落接種于10 ml 12°P麥汁培養(yǎng)基中，23 ℃靜置發(fā)酵7 d，用2株出始菌株發(fā)酵做對照，蒸餾后測定酒中甲醇、總酯含量。

1.3 皂化回流法測定總酯 吸取25.0 ml酒樣到250 ml三角瓶，加25 ml水、2滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色，測定總酸；再加入5.0 ml 0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，沸水浴中回流皂化0.5 h，冷卻后轉(zhuǎn)到250 ml碘量瓶，立即用0.1 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色剛好消失，計(jì)算酒中總酯：

X=C×（V0-V1）×88/25。

式中，X為酒中總酯的質(zhì)量濃度（g/L），C為HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的實(shí)際濃度（mol/L），V0為空白對照樣品消耗HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml），V1為樣品消耗HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml），88為乙酸乙酯的摩爾質(zhì)量（g/mol），25為吸取樣品體積（ml）。

1.4 甲醇的頂空色譜測定

1.4.1 色譜分離條件。N2流速1.0 ml/min，干燥空氣流速350 ml/min，H2流速30 ml/min，壓力72.8 112 kPa，分流比50∶1，檢測器溫度250 ℃，汽化室溫度150 ℃，進(jìn)樣量1 μl。采用程序升溫：先35 ℃保溫4 min，再以20 ℃/ min升溫到180 ℃，并保溫5 min。

1.4.2 頂空進(jìn)樣條件。頂空瓶溫度80 ℃，平衡時(shí)間5 min，定量環(huán)溫度85 ℃，氣體填充時(shí)間0.5 min，平衡時(shí)間0.1 min，氣體傳輸線溫度90 ℃，樣品瓶壓力平衡0.2 min，進(jìn)樣時(shí)間1 min，振蕩幅度為1。

1.4.3 樣品的制備。9 ml的發(fā)酵蒸餾酒與1 ml的內(nèi)標(biāo)溶液（3 g/L的乙酸丁酯）混合成樣品，酒精度為40%vol。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的確認(rèn)

按“1.2.1”方法制備好雙親的原生質(zhì)體，并分別涂布接種于HCM平板和CM平板上，28 ℃下倒置培養(yǎng)3 d，在HCM上有菌落生長，而在CM上無菌落長出，這說明已制得原生質(zhì)體。

2.2 融合子的篩選

按“1.2.2”方法進(jìn)行雙親原生質(zhì)體的融合，并涂布在HCM板上培養(yǎng)，28 ℃下倒置培養(yǎng)3 d后長出菌落，可初步判定這些菌落為融合菌株。因?yàn)榻?jīng)紫外照射70 s的低甲醇酵母原生質(zhì)體和經(jīng)60 ℃熱處理的濃香酵母原生質(zhì)體都已經(jīng)失活而不能長出菌落。再挑取多個(gè)菌落進(jìn)行發(fā)酵，以復(fù)篩融合子，融合子進(jìn)行發(fā)酵分析的試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。

3 結(jié)論與討論

利用原生質(zhì)體融合技術(shù)成功選育出1株低甲醇高總酯的融合菌株，與初始低甲醇酵母菌株發(fā)酵蒸餾酒的相對甲醇含量188.21 mg/L相比，其相對甲醇含量為145.31 mg/L，降低22.8%；發(fā)酵酒中總酯含量為0.79 g/L，比初始低甲醇酵母菌株的總酯含量（0.43 g/L）升高83.7%，僅比初始高酯香酵母菌株的總酯含量（0.91 g/L）略微降低。

通過對比發(fā)現(xiàn)，融合菌株1、10釀造酒的相對甲醇含量都明顯降低，最低達(dá)到139.54 g/L，這表明原生質(zhì)體融合技術(shù)選育菌株在降低甲醇上是有效的。但對于融合菌株釀造酒的總酯雖然比初始低甲醇酵母菌株的0.43 g/L都顯著提高，但是低于初始高酯香菌株的0.91 g/L，效果不明顯。因此，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育菌種是可行的，對于不同代謝途徑及其代謝產(chǎn)物的育種效果存在一定差異，分析產(chǎn)生差異的原因還需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 武曉娜，康富帥，閻銳鳴，等.釀酒酵母與甘氨酸發(fā)酵生成甲醇關(guān)系的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（25）：12642，12645.

[2] 賀瑞鳳.蒸餾酒及配制酒中甲醇測定方法的探討[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，11（12）：3242-3244.

[3] ZHOU D P，PING W X，SUN J Q，et al.Breeding new strains of saccharomyces cerevisiae by inactivated protoplast fusion [J].Microbial Technology，1999，10（5）：454-460.

[4] ANNIE JULIET GNANAM.Protoplast fusion techniques in fungi[J].Fungal Biology，2013，45：483-488.

[5] 王芬，由媛，全麗，等.雙親滅活的原生質(zhì)體融合株啤酒酵母DR92的構(gòu)建及其特性的研究[J].釀酒科技，2007，9（5）：72-74.

[6] KRISHNAMOORTHY R N，NARAYANAN R，VIJILA K.Intergeneric protoplast fusion of yeast for high ethanol production from cheese industry wasteWhey [J].Journal of Yeast and Fungal Research，2010（5）：81-87.

[7] ZHOU X W，WEI Y M，ZHU H F，et al.Protoplast formation，regeneration and transformation from the taxolproducing fungus Ozonium sp.[J].Afr J Biotechnol，2008，7（12）：2017-2024.