朱連勤 朱風(fēng)華 朱祖賢 高晨 陳甫 王光 黃凱 宋明明

摘 要：本試驗(yàn)旨在研究霉變飼料和/或添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑對(duì)肉雞人工感染發(fā)生的影響。選取140羽1日齡健康的AA肉雞隨機(jī)分成7個(gè)組，每組4個(gè)重復(fù)。第1組為空白對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；第2組飼喂霉變飼料；第3～7組以混合感染病雞病變組織勻漿飲水制作人工感染疾病模型；第3～7組分別飼喂基礎(chǔ)日糧、霉變飼料、霉變飼料+復(fù)方霉菌毒素吸附劑、霉變飼料+復(fù)方霉菌毒素吸附劑+抗氧化劑、霉變飼料+復(fù)方霉菌毒素吸附劑+抗氧化劑+中藥增免劑。試驗(yàn)期35d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肉雞攝入霉變飼料與攝入正常飼料相比，提高肉雞料重比和死淘率，顯著降低肉雞增重、胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)，顯著降低血清IBDV、H9N1V和NDV抗體水平（P<0.05）。給人工感染肉雞飼喂霉變飼料與飼喂正常飼料相比，顯著提高料重比和死淘率，顯著降低肉雞增重、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，顯著降低血清IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-12含量以及LTR，顯著降低血清IBDV、H9N1V和NDV抗體水平（P<0.05）。霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑能顯著提高混合感染肉雞增重，并降低料重比和死淘率（P<0.05），顯著提高胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)（P<0.05），顯著提高血清IBDV、H9N1V和NDV抗體水平（P<0.05）?？梢?，霉變飼料可導(dǎo)致肉雞免疫功能抑制，加重肉雞混合感染病情；復(fù)方霉菌毒素吸附劑能有效緩解霉變飼料對(duì)人工感染肉雞生產(chǎn)性能、免疫功能和病情的不利影響，抗氧化劑和免疫功能增強(qiáng)劑可減輕霉變飼料的毒性作用。

關(guān)鍵詞：霉菌毒素；復(fù)方霉菌毒素吸附劑；人工感染；氧化損傷；免疫功能；肉雞

中圖分類號(hào)：S816.79 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1673-1085（2014）12-0012-06

霉菌毒素對(duì)免疫系統(tǒng)的破壞及對(duì)免疫應(yīng)答抑制是主要的毒性作用之一，導(dǎo)致動(dòng)物抗病力下降，對(duì)病原的易感性增強(qiáng)[1]。但對(duì)于飼料霉菌毒素可能造成家禽免疫失敗和混合感染多發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，卻認(rèn)識(shí)不足；普遍認(rèn)為家禽混合感染是因疫苗免疫失敗、免疫抑制性病原、濫用藥物等因素導(dǎo)致家禽抗病力下降所致[2]。近年來，許多研究報(bào)道飼料中霉菌毒素污染呈現(xiàn)居高不下的態(tài)勢(shì)[3]，已經(jīng)引起養(yǎng)殖業(yè)界的重視。探索霉菌毒素在肉雞混合感染中扮演的角色，以及復(fù)方霉菌毒素吸附劑對(duì)肉雞的保護(hù)作用，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)旨在通過研究霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑對(duì)肉雞混合感染發(fā)生的影響，確定霉菌毒素在肉雞混合感染發(fā)生上可能扮演的角色，并進(jìn)一步驗(yàn)證由本實(shí)驗(yàn)室研制的復(fù)方霉菌毒素吸附劑的效果，為其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與處理 選取140羽1日齡的肉雞，隨機(jī)分為7組，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)。第1組為空白對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；第2組為陽性對(duì)照組，飼喂霉變飼料；第3組飼喂基礎(chǔ)日糧；第4組飼喂霉變飼料；第5組飼喂添加0.2%復(fù)方霉菌毒素吸附劑的霉變飼料；第6組飼喂添加0.2%復(fù)方霉菌毒素吸附劑+抗氧化劑的霉變飼料；第7組飼喂添加0.2%復(fù)方吸附劑+抗氧化劑+中藥增免劑的霉變飼料。第3～7組均以混合感染病雞病料勻漿飲水制作混合感染疾病模型。試驗(yàn)期35d。

1.2 基礎(chǔ)日糧和霉變飼料 基礎(chǔ)日糧購(gòu)自某飼料公司。把基礎(chǔ)日糧置于陰暗潮濕處使其自然發(fā)霉為霉變飼料，在霉變飼料使用前加入0.15%丙酸鈣，混合均勻，抑制霉菌繼續(xù)生長(zhǎng)。配制各組飼料時(shí)加入適量禽香。使用前檢測(cè)霉變飼料中ZEN、DON、FB1和AFB1含量，見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)肉雞均自由采食、飲水，籠養(yǎng)，舍內(nèi)通風(fēng)良好，光照、溫度和濕度按照飼養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行控制，及時(shí)清理糞尿，并做好消毒工作。按照常規(guī)免疫程序和方法，接種新城疫Ⅳ系+傳支H120二聯(lián)凍干苗、新城疫+禽流感二聯(lián)油苗和傳染性法氏囊病疫苗。

將第1組和第2組受試雞與其他組受試雞隔離飼養(yǎng)，防止交叉?zhèn)魅尽?/p>

1.4 肉雞混合感染疾病模型的建立 選取混合感染特征明顯的病雞內(nèi)臟（肝臟、小腸、心臟和肺臟），與生理鹽水1：1比例，碾磨成均勻漿液，按照每羽雞每次0.1ml漿液加入水中，在第7天讓肉雞自由飲入。每天1次，連續(xù)4d。

1.5 藥品和試劑 復(fù)方霉菌毒素吸附劑由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病與中毒病實(shí)驗(yàn)室研制；ConA和MTT購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；RPMI-1640和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GBICO公司；二甲基亞砜購(gòu)自北京索來寶公司；干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-12（IL-12）等檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程有限公司；ZEN、DON、FB1、AFB1和雞新城疫抗體、雞傳染性法氏囊病抗體和禽流感抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海勁馬科技生物有限公司。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 生產(chǎn)性能檢測(cè) 試驗(yàn)至35d時(shí)，禁食12h，稱取每重復(fù)受試雞體重，稱量各組飼料重和剩余飼料重，計(jì)算每組受試雞平均日增重和料重比。

1.6.2 癥狀和病理變化 試驗(yàn)期間觀察并記錄肉雞發(fā)病情況及癥狀，對(duì)死亡雞進(jìn)行剖檢并詳細(xì)記錄病理變化。

1.6.3 死淘率的測(cè)定 死淘率（%）=[試驗(yàn)開始時(shí)數(shù)量（羽）-試驗(yàn)結(jié)束時(shí)數(shù)量（羽）]/試驗(yàn)開始時(shí)數(shù)量（羽）×100。

1.6.4 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（LTR）的檢測(cè) 試驗(yàn)至35d時(shí)，翅靜脈采血1ml，肝素鈉抗凝，用MTT法（四甲基偶氮唑鹽）測(cè)定外周血的LTR。

1.6.5 胸腺、脾臟、法氏囊指數(shù)的測(cè)定 試驗(yàn)至35d，每組隨機(jī)殺5羽雞，準(zhǔn)確稱量體重，并迅速取出胸腺、脾臟、法氏囊，剔除附著組織，于生理鹽水中漂洗，用濾紙吸干，分別稱重，計(jì)算各臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)（mg/g）=臟器重（mg）/體重（g）

1.6.6 血清中IBDV、H9N1V和NDV抗體水平的檢測(cè) 在14、21、28和35日齡，每重復(fù)隨機(jī)抽取1羽雞（做好記號(hào)，不重復(fù)采血），心臟采血5ml，離心取血清，檢測(cè)血清中IBDV、H9N1V和NDV抗體的水平。

1.6.7 細(xì)胞因子的檢測(cè) 試驗(yàn)至35d時(shí)，用試劑盒檢測(cè)血清干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-12（IL-12）的含量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和最小顯著差異檢驗(yàn)方法，對(duì)各均值進(jìn)行多重比較，結(jié)果用±SD表示。

2 結(jié)果

2.1 肉雞混合感染疾病模型的建立 人工感然肉雞從14日齡開始出現(xiàn)癥狀，至21日齡時(shí)發(fā)病雞病情加重，27日齡后發(fā)病雞病情趨緩，第4、5、6組肉雞發(fā)病早。發(fā)病雞初期癥狀為：伸頸、張口呼吸、有啰音，有的咳嗽，流鼻，口腔內(nèi)有透明粘液；病雞精神沉郁、食欲減退、羽毛蓬松、翅膀下垂。隨著病情加重，除呼吸道癥狀加劇外，病雞站立不穩(wěn)，臥倒或匍匐在地，關(guān)節(jié)腫大，四肢僵硬且腹部沾有大量糞便，閉眼，反應(yīng)遲鈍。許多雞的肛門松弛，收縮無力，尾部羽毛粘著石灰渣樣的固體物。

解剖可見病雞腿部肌肉有淤血，有的有出血點(diǎn)，有的則大面積出血；病雞氣囊有積液，有黃色或白色纖維素滲出物；氣管內(nèi)蓄滿大量渾濁粘液，并伴有白色或黃色絮狀物，有的氣管壁大面積出現(xiàn)紅腫或出現(xiàn)淤血。部分病雞腹腔有少量積液，各組病雞腎臟都出現(xiàn)尿酸鹽沉積，表現(xiàn)出明顯的“花斑腎”，可見輸尿管增寬腫大，內(nèi)有白色石灰樣物充盈；有個(gè)別雞肌胃出現(xiàn)潰瘍；各組均有雞均出現(xiàn)纖維蛋白包心包肝；個(gè)別發(fā)病雞脾臟腫脹，可見大小不一的灰白色壞死灶，有的則出現(xiàn)細(xì)小的出血點(diǎn)；各組均有病雞腸道發(fā)現(xiàn)出血點(diǎn)；部分病雞胸腺腫大，有的淤血嚴(yán)重，有的可見明顯的出血點(diǎn)；各組病雞關(guān)節(jié)內(nèi)充滿白色的膠凍樣粘液。

2.2 霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑對(duì)人工感染肉雞生產(chǎn)性能和死淘率的影響 與空白對(duì)照組相比，飼喂霉變飼料的肉雞平均日增重顯著降低、料重比顯著提高（P<0.05），人工感染的肉雞平均日增重顯著降低（P<0.05）、死淘率升高。給人工感染肉雞飼喂霉變飼料比飼喂正常飼料顯著降低平均日增重、顯著提高料重比和死淘率（P<0.05）。在人工感染肉雞采食的霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑，顯著降低肉雞死淘率和料重比、提高平均日增重（P<0.05），見表2。

2.3 霉變飼料中添加霉菌毒素復(fù)方吸附劑對(duì)人工感染肉雞免疫細(xì)胞因子和LTR的影響 與空白對(duì)照組相比，飼喂霉變飼料肉雞血清IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-12含量以及LTR顯著降低（P<0.05），人工感染肉雞血清IL-12含量顯著升高、LTR顯著降低（P<0.05）。給人工感染肉雞飼喂霉變飼料與飼喂正常飼料相比，血清IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-12含量以及LTR顯著降低（P<0.05）。在人工感染肉雞采食的霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑，肉雞血清IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-12含量以及LTR顯著升高（P<0.05），同時(shí)添加抗氧化劑和中藥免疫增強(qiáng)劑效果更好，見表3。

2.4 霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑對(duì)人工感染肉雞免疫器官指數(shù)的影響 與空白對(duì)照組相比，飼喂霉變飼料的肉雞胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著降低（P<0.05），人工感染肉雞胸腺指數(shù)顯著降低（P<0.05）。給人工感染肉雞飼喂霉變飼料與飼喂正常飼料相比，肉雞胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著降低（P<0.05）。在人工感染肉雞采食的霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑，肉雞胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著升高（P<0.05），見表4。

2.5 霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑對(duì)人工感染肉雞血清中IBDV、H9N1V和NDV抗體水平的影響

2.5.1 霉變飼料中添加霉菌毒素復(fù)方吸附劑對(duì)人工感染肉雞血清中IBDV抗體水平的影響 與空白對(duì)照組相比，飼喂霉變飼料肉雞血清IBDV抗體水平顯著降低（P<0.05）。給人工感染肉雞飼喂霉變飼料與飼喂正常飼料相比，血清IBDV抗體水平顯著降低（P<0.05）。在人工感染肉雞采食的霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑，雞血清IBDV抗體水平顯著升高（P<0.05），見表5。

2.5.2 霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑對(duì)人工感染肉雞血清中H9N1V抗體水平的影響 與空白對(duì)照組相比，飼喂霉變飼料肉雞血清H9N1V抗體水平顯著降低（P<0.05）。給人工感染肉雞飼喂霉變飼料與飼喂正常飼料相比，血清H9N1V抗體水平顯著降低（P<0.05）。在人工感染肉雞采食的霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑，肉雞血清H9N1V抗體水平顯著升高（P<0.05），見表6。

2.5.3 霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑對(duì)人工感染肉雞血清中NDV抗體水平的影響 與空白對(duì)照組相比，飼喂霉變飼料肉雞血清NDV抗體水平顯著降低（P<0.05）。給人工感染肉雞飼喂霉變飼料與飼喂正常飼料相比，血清NDV抗體水平顯著降低（P<0.05）。在人工感染肉雞采食的霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑，肉雞血清NDV抗體水平顯著升高（P<0.05），見表7。

3 討論

3.1 霉變飼料對(duì)肉雞人工感染發(fā)生的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，給肉雞攝入霉變飼料顯著降低其日增重、提高料重比和死淘率。與Aravind等[4]的報(bào)道一致，肉雞攝入自然霉變飼料能顯著降低平均日增重、采食量和飼料轉(zhuǎn)化率。馮光德等[5]也報(bào)道，肉鴨的死亡率隨著霉變玉米用量的增加而呈極顯著的線性增加?？梢?，本試驗(yàn)成功建立了肉雞霉變飼料中毒病例模型。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給攝入常規(guī)飼料肉雞接種肉雞病變組織勻漿液，肉雞死淘率顯著高于空白對(duì)照組，死亡肉雞剖檢病理變化符合混合感染的病變特征，成功地建立了肉雞人工感染疾病模型。在給試驗(yàn)雞接種肉雞病變組織勻漿液的情況下，攝入霉變飼料降低平均日增重、提高料重比和死淘率的幅度遠(yuǎn)高于攝入常規(guī)飼料。可見，肉雞攝入霉變飼料可加重混合感染發(fā)生的程度。究其原因，可能與霉菌毒素導(dǎo)致肉雞抗病力下降有關(guān)。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，肉雞攝入霉變飼料其血清IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-12含量以及LTR顯著低于空白對(duì)照組，胸腺和脾臟指數(shù)顯著降低，血清IBDV、H9N1V和NDV抗體水平顯著降低。徐雪梅等[6]報(bào)道，霉變飼料顯著降低肉雞新城疫抗體滴度。何健等[7]研究發(fā)現(xiàn)，給肉鴨飼喂自然霉變玉米能顯著降低禽流感 H5N1V特異性抗體滴度。汪前紅等[8]研究表明，隨著日糧中黃曲霉毒素B1含量的增加，肉鴨禽流感疫苗抗體水平顯著下降。Okotie等[9]在肉雞日糧中添加黃曲霉毒素5mg/kg，發(fā)現(xiàn)肉雞的IBDV抗體水平顯著下降。由此可見，肉雞攝入霉變飼料可以加重肉雞混合感染的發(fā)生程度；霉菌毒素導(dǎo)致肉雞免疫功能抑制、抗病力下降，是導(dǎo)致混合感染肉雞死亡率升高的重要原因?？刂泼咕舅囟竞驕p少飼料中霉菌毒素含量，是解決肉雞混合感染發(fā)生發(fā)展的重要途徑。

3.2 霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑對(duì)肉雞人工感染發(fā)生的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，給肉雞攝入的霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑，降低肉雞死淘率；接種肉雞病變組織勻漿液和攝入霉變飼料的肉雞死淘率顯著高于添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑。通過觀察免疫器官指數(shù)、血清細(xì)胞因子水平以及IBDV、H9N1V和NDV抗體水平變化，發(fā)現(xiàn)霉變飼料中添加復(fù)方霉菌毒素吸附劑，可以扭轉(zhuǎn)肉雞免疫抑制現(xiàn)象，同時(shí)添加增強(qiáng)免疫功能的藥物，效果更好。李振等[10]也證明在霉變飼料中添加0.2%酵母細(xì)胞壁，顯著提高IL-6和IFN-γ相對(duì)表達(dá)量，顯著提高NDV抗體水平。Kubena等[11]在含AF 5mg/kg飼糧中添加0.25%的水合硅鋁酸納鈣可有效解除AF對(duì)肉雞脾淋巴細(xì)胞增殖的抑制，并使胸腺淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率升高?？梢?，霉菌毒素吸附劑能有效緩解霉菌毒素導(dǎo)致家禽免疫抑制的不利影響，減輕混合感染的發(fā)病程度。

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