尚英彬　王展　陳芳園　龐瑩　席鵬　任秋實(shí)

[摘要]目的：本研究擬定量地比較Q開關(guān)和長(zhǎng)脈寬1064 nm摻釹：釔-鋁石榴石（neodymium-yttrium-aluminum garnet， Nd：YAG）激光誘導(dǎo)真皮膠原重建的療效。方法：應(yīng)用Q開關(guān)和長(zhǎng)脈寬1064 nm Nd：YAG激光分別對(duì)36只雌性昆明小鼠左側(cè)后背皮膚進(jìn)行連續(xù)4次治療，每次間隔1周，右側(cè)相應(yīng)的部位作為自身對(duì)照。分別于第1次治療后1h、1天、7天、21天、30天和60天對(duì)小鼠皮膚行活組織取材。應(yīng)用免疫組化方法分別對(duì)皮膚組織樣品中真皮I、III型膠原進(jìn)行檢測(cè)，染色結(jié)果應(yīng)用Motic醫(yī)學(xué)數(shù)字圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，Q開關(guān)1064 nm Nd：YAG激光治療后7天、21天、30天和60天，真皮I型膠原及III型膠原水平明顯增高（均P<0.01）。長(zhǎng)脈寬1064 nm Nd：YAG激光治療后21天、30天和60天，真皮I型膠原水平明顯增高（均P<0.01）；激光治療后7天、21天、30天和60天，真皮III型膠原水平明顯增高（分別為P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.01）。兩組激光的比較：激光治療后7天、21天和30天，Q開關(guān)1064nm Nd：YAG激光治療組真皮I型膠原水平較長(zhǎng)脈寬1064nm Nd：YAG激光治療組明顯增高（均P<0.01），而激光治療后60天明顯降低（P<0.05）；激光治療后7天和21天，Q開關(guān)1064nm Nd：YAG激光治療組較長(zhǎng)脈寬1064nm Nd：YAG激光治療組真皮III型膠原水平明顯增高（分別為P<0.05、P<0.01）。結(jié)論：Q開關(guān)和長(zhǎng)脈寬1064nm Nd：YAG激光均可引起真皮膠原重建，但二者的作用效果不盡相同。

[關(guān)鍵詞]非剝脫性激光嫩膚；膠原重建；Nd：YAG激光

[中圖分類號(hào)]R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2014）02-0121-04

Q開關(guān)1064 nm Nd：YAG激光和長(zhǎng)脈寬1064 nm Nd：YAG激光是目前臨床上較常用的兩種非剝脫性嫩膚技術(shù)，二者波長(zhǎng)相同，屬于發(fā)射近紅外光波長(zhǎng)的激光，但因脈寬不同，與皮膚組織的相互作用方式不同。Q開關(guān)1064 nm Nd：YAG激光主要是對(duì)皮膚組織產(chǎn)生光機(jī)械作用誘導(dǎo)真皮膠原重建而嫩膚 [1-2]，而長(zhǎng)脈寬1064 nm Nd：YAG激光主要是通過光熱效應(yīng)達(dá)到嫩膚的目的[1，3]。

迄今為止，缺乏系統(tǒng)性的對(duì)Q開關(guān)1064 nm Nd：YAG激光和長(zhǎng)脈寬1064 nm Nd：YAG激光誘導(dǎo)真皮膠原重建療效的比較性研究，本研究以雌性昆明小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，利用免疫組化方法和計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)定量地評(píng)價(jià)和比較Q開關(guān)和長(zhǎng)脈寬1064 nm Nd：YAG激光誘導(dǎo)真皮膠原重建的療效，以揭示二者引起膠原重建的特點(diǎn)，為指導(dǎo)臨床實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性昆明小鼠36只，8～10周齡，體重約30g， 由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，按取材時(shí)間點(diǎn)不同隨機(jī)分6組，每組6只。

1.2 激光照射：參照文獻(xiàn)[1-2，4]，實(shí)驗(yàn)前24h將小鼠背部皮膚應(yīng)用市售脫毛膏行脫毛處理，然后于10%水合氯醛1ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉下行激光照射治療，治療參數(shù)如表1，分別對(duì)小鼠左側(cè)背部上下部位行Q開關(guān)1064 nm Nd：YAG激光和長(zhǎng)脈寬1064nm Nd：YAG激光治療，右側(cè)相應(yīng)的部位作為自身對(duì)照，照射激光的光斑有10%重疊，每個(gè)部位重復(fù)照射3遍，共連續(xù)治療4次，每次之間間隔1周。第1次激光照射后1h、1天、7天、21天、30天和60天分別對(duì)小鼠皮膚進(jìn)行活組織取材，其中第3次和第4次取材是在相應(yīng)的治療前，皮膚組織取下后立即放入10%福爾馬林中固定。

1.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用鏈酶親和素-生物素-酶復(fù)合物（StreptAvidin-Biotin-enzyme Complex， SABC）染色試劑盒（博士德生物工程有限公司，武漢），一抗為兔抗小鼠I、III型膠原多克隆IgG抗體（博士德生物工程有限公司，武漢），實(shí)驗(yàn)步驟按說明書操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Motic醫(yī)學(xué)數(shù)字圖像分析系統(tǒng)對(duì)二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride， DAB）陽性染色的切片進(jìn)行定量分析。400×下隨機(jī)選取3個(gè)視野，分別計(jì)算小鼠真皮I、III型膠原陽性表達(dá)面積和統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積的百分比，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所測(cè)的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用SPSS15.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（analysis of variance， ANOVA），P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 真皮I型膠原免疫組化染色結(jié)果：見圖1，Q開關(guān)1064 nm Nd：YAG激光治療后7天時(shí)開始明顯升高，30天時(shí)達(dá)高峰，60天時(shí)較30天時(shí)有所下降。長(zhǎng)脈寬1064 nm Nd：YAG激光治療后21天時(shí)開始明顯升高，60天時(shí)達(dá)高峰。與正常對(duì)照組相比，Q開關(guān)1064 nm Nd：YAG激光治療組于治療后7天、21天、30天和60天明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），長(zhǎng)脈寬1064 nm Nd：YAG激光治療組于治療后21天、30天和60天明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）。兩組激光比較：Q開關(guān)1064 nm Nd：YAG激光治療組于治療后7天、21天和30天較長(zhǎng)脈寬1064 nm Nd：YAG激光治療組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為P<0.01，P<0.01，P<0.01），于治療后60天較長(zhǎng)脈寬1064 nm Nd：YAG激光治療組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 真皮III型膠原免疫組化染色結(jié)果：見圖2，Q開關(guān)1064 nm Nd：YAG激光治療后7天后始明顯升高， 21天達(dá)到高峰，之后逐漸降低。長(zhǎng)脈寬1064 nm Nd：YAG激光治療后7天開始明顯升高，30天時(shí)達(dá)到高峰，60天時(shí)較30天有所降低。與正常對(duì)照組相比，Q開關(guān)1064 nm Nd：YAG激光治療組于激光治療后7天、21天、30天和60天明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）；長(zhǎng)脈寬1064 nm Nd：YAG激光治療組于治療后7天、21天、30天和60天明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.01）。兩組激光比較：Q開關(guān)1064 nm Nd：YAG激光治療組于治療后7天和21天較長(zhǎng)脈寬1064 nm Nd：YAG激光治療組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為P<0.05，P<0.01）。

3 討論

皮膚光老化的各種治療方法中，非剝脫性嫩膚技術(shù)因療效確切、副作用小等特點(diǎn)具有明顯的優(yōu)勢(shì)[5-6]。正常真皮組織的細(xì)胞外基質(zhì)主要有I型膠原構(gòu)成，還有一小部分III型膠原、彈性蛋白、蛋白多糖和纖維粘連蛋白[7]。皮膚光老化的組織學(xué)改變主要表現(xiàn)為真皮膠原退行性變，排列紊亂，I型和III型膠原水平下降。 因此非損傷性激光嫩膚療效的評(píng)價(jià)多是通過組織學(xué)水平檢測(cè)真皮膠原水平的變化來實(shí)現(xiàn)的。

本研究通過免疫組化實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)經(jīng)連續(xù)4次激光治療的小鼠真皮I型和III型膠原進(jìn)行染色，結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，定量地檢測(cè)和比較了Q開關(guān)1064nm Nd：YAG激光和長(zhǎng)脈寬1064nm Nd：YAG激光的療效。通過對(duì)不同時(shí)間檢測(cè)點(diǎn)小鼠真皮I型和III型膠原水平的動(dòng)態(tài)研究發(fā)現(xiàn)Q開關(guān)1064nm Nd：YAG激光和長(zhǎng)脈寬1064nm Nd：YAG激光均可引起真皮膠原重建，既可誘導(dǎo)I型膠原增多，又可誘導(dǎo)III型膠原增多。其中Q開關(guān)1064nm Nd：YAG激光引起膠原重建起效早且作用強(qiáng)，但長(zhǎng)脈寬1064 nm Nd：YAG激光具有良好的遠(yuǎn)期療效。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，臨床上進(jìn)行非剝脫性嫩膚治療時(shí)，將Q開關(guān)和長(zhǎng)脈寬1064nm Nd：YAG激光聯(lián)合應(yīng)用，治療早期即可較快地引起新生膠原增多，快速地改善皮膚光老化的臨床癥狀，又可保證膠原重建療效的持久性，從而獲得理想的嫩膚效果。

目前激光引起真皮膠原重建的機(jī)制還不明了，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是激光作用于皮膚誘導(dǎo)了真皮的可控性損傷，啟動(dòng)了皮膚的創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)，從而導(dǎo)致真皮成纖維細(xì)胞增生和膠原重建[8-10]。Q開關(guān)1064nm Nd：YAG激光和長(zhǎng)脈寬1064nm Nd：YAG激光二者雖然波長(zhǎng)相同，但與皮膚組織的作用方式不同，Q開關(guān)1064 nm Nd：YAG激光，應(yīng)用調(diào)Q技術(shù)，脈寬極短，達(dá)納秒級(jí)，限制熱損傷局限于靶部位，減少熱量向周圍組織彌散。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如黑素小體等吸收激光能量后在極短的時(shí)間內(nèi)來不及發(fā)生熱傳導(dǎo)，受熱急劇膨脹，產(chǎn)生沖擊波作用于周圍真皮組織，因此Q開關(guān)1064nm Nd：YAG激光主要是對(duì)皮膚組織產(chǎn)生光機(jī)械作用達(dá)到嫩膚的目的[1-2]。而長(zhǎng)脈寬1064nm Nd：YAG激光脈寬較長(zhǎng)，達(dá)毫秒級(jí)，其中0.3ms脈寬可被真皮內(nèi)微血管中的氧合血紅蛋白累積性吸收，熱量向周圍彌散，逐漸加熱周圍乳頭層和網(wǎng)狀層真皮，因此該激光主要是對(duì)靶組織產(chǎn)生光熱效應(yīng)，進(jìn)而通過后續(xù)反應(yīng)達(dá)到嫩膚的目的[1，3]。本研究中結(jié)果證實(shí)無論是光機(jī)械作用還是光熱作用均可引起真皮膠原重建，但由于二者與皮膚組織的相互作用方式不同，機(jī)械性損傷和熱損傷引起的修復(fù)反應(yīng)方式不完全相同，從而引起真皮膠原重建的效果不盡相同。兩種損傷是如何引起皮膚創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)的啟動(dòng)目前還不清楚，其確切的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

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[收稿日期]2013-11-14 [修回日期]2013-12-09

編輯/張惠娟